     ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI AVVERTENZE: Utilizzare tessuti freschi o correttamente conservati La QUALITA’ del materiale di partenza influenza la qualità e la resa del DNA isolato Evitare di agitare fortemente o di pipettare Molecole grandi di DNA sono facilmente danneggiate dalle forze frizionali Lavorare in sterilità per prevenire contaminazioni da nucleasi Autoclavare soluzioni e strumenti Aggiungere alle soluzioni EDTA per chelare gli ioni Mg2+ necessari per l’attività delle DNasi Trattare materiali e soluzioni con DEPC per inibire le RNasi     

       ...ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI PROCEDURA: Rottura dei tessuti (mortaio e pestello, omogeneizzatori…) Digestione enzimatica della parete cellulare e lisi della membrana plasmatica Trattamenti con RNasi e DNasi Deproteinizzazione mediante soluzioni acquose di fenolo/cloroformio Le proteine denaturate rimangono all’interfaccia fra la fase organica e quella acquosa Precipitazione con etanolo o isopropanolo Conservazione a -20°C/-80°C in un tampone contenente EDTA Il DNA è soggetto a idrolisi acida se conservato in acqua        PROCEDURA:

   CARATTERIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA CONCENTRAZIONE: PUREZZA: A260 = 1 OD [DNA]= 50 mg/ml [RNA]= 40 mg/ml Misurazione dell’assorbimento a 260 nm  PUREZZA: Rapporto A260/A280 A260/A280 = 1.7/1.9 (DNA) A260/A280 = 1.9/2.1 (RNA)  Le misure spettrofotometriche non differenziano fra DNA ed RNA Il fenolo ha un massimo di assorbimento a 270-275 nm 

CONTROLLO INTEGRITA’ e TAGLIA Elettroforesi su gel di agarosio 1 2 3 4 5 28 S 26 S 18 S 25 S 23 S 16 S M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Kb 97.0 48.5 M: Markers 1: Sangue 2: Cellule HeLa 3: Cellule CHO 4: E. coli 5: B. subtilis 6: Coda di topo 7: Fegato 8: SS. cerevisiae 1: Topo 2: Uomo 3: Lievito 4: Batterio 5: Pianta

ISOLAMENTO mRNA AAA AAAA RNA cellulare totale TTT TTTTT Oligo dT-cellulosa . AAAAA NaCl 100 mM L’mRNA con poli(A) si ibrida con l’oligo(dT) TRIS 10 mM EDTA 1 mM Viene eluito l’mRNA L’rRNA ed il tRNA vengono eluiti Solo gli mRNA possiedono code di poli(A) lunghe 30-150 residui. Le sequenze di oligo(dT) sono immobilizzate su supporti solidi, generalmente di cellulosa. L’RNA viene denaturato e quindi applicato alla colonna in una soluzione salina concentrata (NaCl 0.5 M). Si effettuano molti lavaggi con una soluzione salina meno concentrata (NaCl 100 mM) per rendere più selettivo il legame tra RNA e oligo(dT). Aggiungendo una soluzione di TRIDS/EDTA si recupera l’mRNA legato alla colonna.

STRUTTURA degli ACIDI NUCLEICI

ANALISI FISICA Effetto ipercromico: Grado di denaturazione (%) 40 60 80 100 50 1.3 1.2 1.1 1.0 Temperatura (°C) Assorbanza a 260 nm Tm Curva di fusione Effetto ipercromico: Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA. Temperatura di melting (Tm): Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%. Maggiore è G+C, maggiore è Tm.

CINETICA di RINATURAZIONE Log Cot Rinaturazione (%) DNA a rinaturazione rapida 50 100 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Curva C0t lenta Effetto ipocromico: Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA. Parametri che influenzano la rinaturazione: 1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume 2) Tempo La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA

 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di ISOLARE AMPLIFICARE frammenti di DNA SEQUENZIARE  Perché manipolare i geni? 1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica; 2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione; 3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine; 4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici

PROCEDURA di CLONAGGIO ISOLAMENTO del gene INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso…. …..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI

 ENDONUCLEASI di RESTRIZIONE Sono enzimi che tagliano entrambi i filamenti della doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze. Riconoscono SEQUENZE PALINDROMICHE di 4 o 6 nucleotidi 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Entrambe le catene hanno la stessa sequenza se lette in direzione 5’3’ Si distinguono in due classi: Enzimi di CLASSE I Tagliano il DNA in siti adiacenti alla sequenza riconosciuta Enzimi di CLASSE II Tagliano il DNA all’interno della sequenza riconosciuta

 ...ENDONUCLEASI di RESTRIZIONE Possono lasciare estremità: TRONCHE (o blunt) se il taglio cade al centro della sequenza riconosciuta 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’ HpaI 5’-GTT AAC-3’ 3’-CAA TTG-5’ SPORGENTI (o 5’/3’ protruding) dette anche ADESIVE (o sticky) se il taglio avviene a posizioni sfalsate sui due filamenti 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’

 MAPPATURA di RESTRIZIONE E’ il processo di determinazione delle posizioni dei siti di taglio delle endonucleasi di restrizione all’interno di un pezzo di DNA. IMPIEGHI COMUNI: Distinzione di molecole di DNA della stessa lunghezza, ma con sequenze diverse senza doverle sequenziare. Individuazione di mutazioni geniche responsabili di malattie genetiche. Identificazione di un frammento di interesse da un digerito in base al suo peso molecolare. 

...MAPPATURA di RESTRIZIONE 6 2 1 A B TRATTAMENTO DIMENSIONE dei FRAMMENTI (Kb) INTERPRETAZIONE Nessuna digestione Enzima A Enzima B Enzima A+ B 9 7 3 4 2 + 7 3 + 6 2 + 3 + 4 1 + 2 + 6

IDENTIFICAZIONE del FRAMMENTO di INTERESSE mediante Southern blotting 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M Markers 7 SstI/NcoI 1 pBlueStar 8 HinDIII 2 XbaI/SstI 9 NcoI/HinDIII 3 XbaI 10 NcoI 4 BamHI/XbaI 11 NdeI/NcoI 5 NcoI/XbaI 12 BamHI/NcoI 6 NcoI

DNA LIGASI Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente. L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa. CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE: Presenza di ATP 10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore   La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir stabilizzate dalla ligazione. OH P BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’ OH P OH P EcoRI 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’

Transferasi terminale DNA LIGASI OH P FOSFATASI ALCALINA BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’ HpaI 5’-GTT AAC-3’ 3’-CAA TTG-5’ Blunt ends ligation oppure trattamento con Transferasi terminale Sticky ends ligation + dATP + dTTP AAA TTT

+ DNA LIGASI EcoRI BamHI NUCLEASI S1 blunt ends ligation oppure OH P NUCLEASI S1 blunt ends ligation oppure legame con un linker BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’ -GGAATTCC CCTTAAGG- EcoRI 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’ + digestione sticky ends ligation

PLASMIDI Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico, circolare. In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li contengono. Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.  Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere: Dimensioni contenute Un sito di origine della replicazione di tipo batterico controllato in maniera “rilassata” o “stringente” Due geni che conferiscono resistenza a due antibiotici Siti unici di restrizione    

IMPULSO di CORRENTE ELETTRICA TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE METODO CHIMICO METODO ELETTRICO SHOCK TERMICO Le cellule sono rese COMPETENTI mediante: trattamento a freddo con glicerolo trattamento a freddo con ioni Ca2+ Il DNA viene incorporato mediante: IMPULSO di CORRENTE ELETTRICA PIASTRAMENTO SU TERRENO SELETTIVO INATTIVAZIONE INSERZIONALE Quelle che hanno incorporato il plasmide con l’inserto possono essere individuate grazie alla perdita di una funzione metabolica Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.

ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI PIASTRAMENTO PER REPLICA Crescono solo le cellule contenenti il plasmide privo dell’inserto Colonie sviluppatesi su terreno contenente ampicillina Piastra con terreno contenente tetraciclina Recupero delle colonie contenenti il plasmide ricombinante dalle piastre con ampicillina Tampone di velluto Pistramento per replica Incubazione 

Piastra con terreno contenente X-Gal …ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI SCREENING BLU/BIANCO lacZ gene che codifica per la b-galattosidasi interrotto dal sito di clonaggio multiplo (pcs) L’enzima b-galattosidasi è in grado di metabolizzare il substrato incolore X-Gal formando un composto di colore blu. Un ceppo batterico lac-, trasformato con il plasmide ricombinante pUC19, è in grado di metabolizzare il substrato X-Gal solo se il plasmide è privo dell’inserto e forma colonie di colore blu. Piastra con terreno contenente X-Gal Colonie di batteri lac- che contengono plasmidi ricombinanti Colonie di batteri lac+ che contengono plasmidi senza inserto pcs

Curva di crescita di E. coli INTERVALLO (Lag phase) I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco. FASE LOGARITMICA 4 - 5 ore I batteri crescono esponenzialmente. 10 - 11 ore FASE STAZIONARIA La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente. Tempo (h) Densità cellulare (OD600) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5 10 15 20

PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO LISI ALCALINA 1. RISOSPENSIONE E. coli 2. LISI NaOH / SDS RNasi DNA cromosomico DNA plasmidico Centrifugazione 3. NEUTRALIZZAZIONE KAc Precipitato contenente DNA genomico, proteine, detriti cellulari Supernatante contenente il DNA plasmidico

...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr DNA cromosomico DNA plasmidico Bromuro d’etidio Svolgimento della doppia elica e diminuzione della densità idrodinamica Svolgimento della doppia elica compensato dall’introduzione di supereliche Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame rendendo la densità idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.

 VETTORI di ESPRESSIONE MA, OTTENERE NUMEROSE COPIE IDENTICHE di un certo frammento di DNA CLONARE MA, CLONARE IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE OTTENERE DISCRETE QUANTITÀ del PRODOTTO PROTEICO codificato dal gene di interesse  INSULINA ORMONE DELLA CRESCITA UMANO INTERFERONI sono solo pochi esempi di proteine commercializzate prodotte da batteri

 ...VETTORI di ESPRESSIONE PROPRIETA’: Oltre alle normali caratteristiche di un vettore di clonaggio, un vettore per l’espressione di geni in cellule batteriche DEVE POSSEDERE: SEQUENZA PROMOTRICE SEQUENZA SHINE-DALGARNO  a monte di uno o più siti di inserzione del DNA estraneo AVVERTENZE: UTILIZZARE il cDNA CLONARE il cDNA nella CORRETTA CORNICE di LETTURA CONSIDERAZIONI: I batteri non sono in grado di eseguire modificazioni post-traduzionali

ESPRESSIONE di GENI ETEROLOGHI in sistemi batterici Alcuni ceppi ospite sono stati opportunamente ingegnerizzati per l’espressione regolata dei geni. T7 RNA polimerasi promotore T7 lac o gene target pET gene lac I repressore lac T7 gene 1 E. coli RNA DE3 genoma di E. coli IPTG CELLULA OSPITE Per esempio, viene spesso usato un sistema che accoppia al sistema lac di E. coli una RNA polimerasi di batteriofago.

 PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE Derivano da modificazioni del plasmide naturale Ti (Tumor inducing) del batterio del suolo A. tumefaciens che trasforma geneticamente le piante con un processo che rientra normalmente nel suo ciclo vitale. STRATEGIA: Sostituire i geni che causano il tumore con il gene di interesse, lasciando intatti i confini dx e sx necessari all’integrazione del DNA nel genoma della pianta. Confine sinistro Geni vir Auxina Citichinina Opina T-DNA Plasmide Ti ori Catabolismo dell’opina Confine destro Introdurre nel plasmidio: un gene marcatore selezionabile, sia vegetale che batterico; un’origine di replicazione che consenta al plasmidio di duplicarsi in E. coli ; un sito di clonaggio multiplo compreso fra i confini dx e sx. 

...PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE SISTEMA VETTORE BINARIO SISTEMA VETTORE COINTEGRATO Confine destro Confine sinistro A. tumefaciens ori Gene bersaglio Gene marcatore selezionabile vegetale E. coli ori Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens Vettore binario Confine destro Gene bersaglio Gene marcatore selezionabile vegetale E. coli ori Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens Confine sinistro A. tumefaciens ori Geni vir Vettore cointegrato Plasmide Ti disarmato Sequenza DNA omologa RICOMBINAZIONE Un plasmide Ti modificato contenuto in A. tumefaciens reca i geni vir, indispensabili all’integrazione del DNA compreso fra i confini dx e sx nel genoma della pianta.

Il nuovo plasmide entra nelle cellule dal bordo del ritaglio TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE Il nuovo plasmide entra nelle cellule dal bordo del ritaglio Dischetti di foglie poste su una sospensione di cellule di Agrobacterium Dischetti di foglie cresciute su un terreno nutriente selettivo; solo le cellule trasformate si moltiplicano Vengono riprodotte intere piante contenenti il gene introdotto Trasformazione mediata da A. tumefaciens   Elettroporazione  Alto voltaggio protoplasti ➺ Bombardamento con microproiettili  Microproiettili di oro o tungsteno rivestiti di DNA plasmidico

OLTRE AI PLASMIDI... I plasmidi sono i vettori di elezione per clonare piccoli frammenti di DNA (5-10 Kb). INFATTI, Plasmidi di grandi dimensioni sono instabili e possono andare incontro a delezioni spontanee. La trasformazione non avviene efficentemente.  Per clonare frammenti più grandi si impiegano come vettori del DNA dei batteriofagi (virus batterici)che consentono di iniettare grosse molecole di DNA nelle cellule batteriche per infezione. QUINDI, VETTORI FAGICI VETTORI COSMIDICI

DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO Regione non essenziale (circa 20 Kb) Eliminazione del DNA non essenziale DNA da clonare DNA ricombinante Teste e code del virus Assemblaggio in vitro delle particelle virali Il DNA virale entra nelle cellule, viene replicato e dirige la sintesi delle proteine virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove particelle virali assemblate Recupero delle particelle virali e isolamento del DNA clonato Infezione dei batteri DNA virale Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago l, lungo 49 Kb.

COSMIDI Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle caratteristiche essenziali di un plasmide, anche un SITO COS La presenza di questo elemento è determinante per consentire l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del virus che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per infezione.

Cicli ripetuti di replicazione con il meccanismo del cerchio rotante IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE Il DNA virale a doppia elica entra nelle cellule batteriche durante l’infezione come molecola lineare Estremità coesive All’interno della cellula, le estremità si appaiano originando una molecola di DNA circolare Sito cos Concatameri di copie di DNA virale Cicli ripetuti di replicazione con il meccanismo del cerchio rotante Il DNA codifica per le proteine della testa e della coda del virus Il DNA viene inserito nelle teste del virus e tagliato a livello del sito cos Sono aggiunte le code Particella virale infettiva. I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e possono infettare altre cellule batteriche. 5’ •

VETTORI COSMIDICI Sito cos DNA da clonare Gene per la resistenza all’antibiotico Sito di restrizione Taglio del plasmide e del DNA da clonare con lo stesso enzima di restrizione Ligasi (i frammenti sono inseriti a caso fra due cosmidi) Impacchettamento in vitro solo se la distanza fra i due siti cos è compresa fra 37 e 52 Kb Infezione di E. coli con i fagi e selezione delle colonie resistenti all’antibiotico Batterio Il DNA ricircolarizza attraverso i siti cos e viene replicato all’interno del batterio come un plasmide ori

 COSTRUZIONE BIBLIOTECHE GENOMICHE PROCEDURA: Isolamento del DNA genomico Frammenti di 10-40 Kb Restrizione parziale con un enzima che riconosca sequenze tetranucleotidiche Clonaggio in un vettore  Bisogna produrre un numero discreto di cloni per far sì che ogni singolo gene sia presente almeno in un clone. Per il clonaggio di frammenti di centinaia di migliaia di basi si utilizzano come vettori i cromosomi artificiali di lievito.

  CROMOSOMI ARTIFICIALI di LIEVITO Caratteristiche dei plasmidi: Centromero Sequenze telomeriche  Origine di replicazione autonoma Geni marcatori di selezione Siti di clonaggio 

COSTRUZIONE BIBLIOTECHE di cDNA PROCEDURA: Isolamento RNA messaggero Clonaggio in un vettore AAA AAAA Sintesi DNA complementare Trascrittasi inversa Questo tipo di biblioteche sono particolarmente utili per l’espressione dei geni tessuto-specifici. AAAAA-3’ 7-mG TTTT-5’

SINTESI cDNA mRNA 7-mG AAAAA-3’ 7-mG TTTT-5’ Oligo (dT) TTTTT OH Trascrittasi inversa dATP, dCTP, dTTP, dGTP OH-3’ Frammento di Klenow Rnasi H Nucleasi S1 cDNA completo cDNA incompleto

SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA Placche di lisi Punti di riferimento per l’orientazione della replica al termine dell’esperimento • Replica su filtri di nitrocellulosa (conservare le piastre originali) Denaturazione, neutralizzazione elegame del DNA al filtro Ibridizzazione con sonda marcata e lavaggio della sonda non legata 32P Sonda non legata Sonda ibridizzata Autoradiografia Autoradiogramma che mostra la posizione delle sonde ibridizzate Recupero delle placche positive dalla piastra originale

SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla biblioteca. STRATEGIE DI SINTESI: E’ nota la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche (degenerate) più appropriate o si amplifica un frammento del gene di interesse mediante PCR E’ nota la sequenza nucleotidica del gene di interesse CASO 1: CASO 2: Si predice la sequenza nucleotidica che dovrebbe codificare per quella proteina Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come sonda per l’isolamento del corrispondente gene.

Metodo dell’innesco casuale Spostamento dell’incisione MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale NICK TRANSLATION Spostamento dell’incisione -3’ 3’- -5’ 5’- DNA denaturazione aggiunta di inneschi esanucleotidici 3’-GCATGC-5’ 5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’ 3’-TAGCAG-5’ ibridizzazazione Frammento di Klenow, dNTP dATP 32P-dCTP dTTP dGTP Sintesi DNA  DNA sonda marcato riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del nucleotide successivo -3’ 3’- -5’ 5’- DNA G C G C A A G C G C G T T C G G C A A G G C C A A G G C G A A G G C G C A G 32P-dCTP dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’ taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide mediante la DNA polimerasi I  Pol I 3’- -5’