Interferenza e vettori 27-X-06 Per reprimere l’attività genica : metodo definitivo = knock out di un gene, metodo temporaneo : prima antimessaggeri, ora interferenza L’antimessaggero ha un’azione meccanica (appaia il messaggero) L’interferenza è un sistema enzimatico complesso È un sistema fisiologico

Come si può fare interferenza Vediamo come si può dimostrare che esiste l’interferenza e che se si inibisce ricomincia l’attività enzimatica su cui abbiamo interferito Si tratta di fare degli esperimenti che osservano il fenomeno e poi di dimostrare il meccanismo con cui si verifica Per dimostrare che il meccanismo identificato è il responsabile effettivo dell’interferenza devo avere un modello in cui funziona l’interferenza e poi devo bloccare l’interferenza (in un punto del pathway) e ripristinare l’espressione bloccata dalla interferenza.

Espressione di emerald GFP B) Cells transfected with Lipofectamine™ 2000 (efficiency 50%) - 100% tracking of EmGFP and miRNA expression. -1° Hoechst nuclear stain After 48 hours, cells stained with a red lamin stain, and monitored for GFP expression. 2° half of the cells express lamin protein 3° cells expressing EmGFP and lamin A/C stained are combined, cells expressing GFP do not appear to have lamin A/C present, cells stained red for lamin A/C do not appear to have any GFP expression. This demonstrates that cells expressing EmGFP are also all greatly reduced in lamin expression due to the presence of the miRNA that is co-cistronically expressed. Come è il costrutto ? vettore GFP+lamina siRNA

espressione di un micro RNA Vettore per interferenza L’interferenza avviene per effeto di un enzima “dicer” che serve come difesa da RNA virali (forse anche altro) (emerald green fluorescent protein) Sequenze di integrazione retrovirale

se dobbiamo esprimere la GFP e inibire l’espressione di Lamin A/C Come sarà il costrutto ? se dobbiamo esprimere la GFP e inibire l’espressione di Lamin A/C Vettore per interferenza L’interferenza = meccanismo enzimatico specifico di difesa da infezione di dsRNA, presente in quasi tutti gli org. superiori (emerald green fluorescent protein) Sequenze di integrazione retrovirale lamin A/C siRNA small interfereing mi = micro

Interference come difesa A brief history of RNAi: the silence of the genes. Sen GL, Blau HM. Department of Molecular Pharmacology, Baxter Laboratory in Genetic Pharmacology, 269 Campus Dr., CCSR 4225A, Stanford University School of Medicine, Stanford, California 94305, USA. gsen@stanford.edu The use of the RNA interference (RNAi) pathway to eliminate gene products has greatly facilitated the understanding of gene function. Behind this remarkable pathway is an intricate network of proteins that ensures the degradation of the target mRNA. In this review, we explore the history of RNAi as well as highlighting recent discoveries. FASEB J. 2006 Jul;20(9):1293-9. PMID: 16816104 [PubMed - indexed for MEDLINE 1° paper plant cell (petunia) 1990; 2° Neurospora 1992; Sistema enzimatico Dicer 1998-2000

Dimostrazione tramite esperimenti di controllo Dimostrazione: soppressione con antisenso RNA l’interferenza è  dal blocco con antimessaggero ? Come lo dimostrereste ? Un antimessaggero può legare il messaggero e bloccarne il funzionamento (va trasfettato nella cellula) Piccoli RNA possono bloccare l’espressione di un gene osservazione in piante (x cambiar colore alle petunie) osservazione di silenziamento (quelling) in Neurospora crassa

Esperimenti tramite vettori Per ogni esperimento un vettore con caratteristiche specifiche tramite tecniche di DNA ricombinante e trasfezioni vettori di controllo con e senza inserto I exp. overexpression in petunia del gene “chalcone syntase” biosintesi antocianine - colore viola dei fiori fiori binchi = repressione dell’espressione (‘90) II exp. Neurospora crassa (Romano e Macino) sequenze omologhe di geni inibivano temporaneamente specificamente l’attività di molti geni (‘92) III exp. Caenorabditis elegans sequenze senso ed antisenso inibiscono il gene par 1 (gene della partizione) (‘98) IV exp. Verifica che è il dsRNA a innescare l’interferenza

Altre evidenze di RNAi Gli esperimenti a singola elica di RNA erano contaminati da dsRNA Mancavano i controlli giusti di purificazione dell’ RNA Exp con singolo filamento senso o antisenso 10-100 volte minor efficienza rispetto a dsRNA Ipotesi di un prodotto intermedio stabile Exp in C.elegans mostrava interferenza nella II generazione Isolamento di un piccolo RNA da 25 nt antisenso Exp in cellule di Drosofila con firefly luciferase: interferenza con dsRNA 22-23nt con sporgenza libera di 2-3 nt. Si inibisce sia il gene esogeno che endogeno

Interferenza nei mammiferi Nelle cellule di mammifero dsRNA lunghi inducono interferone e blocco della sintesi proteica (traduz.) - alternativa: prova con dsRNA corti Ipotesi di funzionamento in 2 passaggi: 1° taglio del dsRNA in piccoli frgm 22-23nt 2° taglio del mRNA specifico Exp. di centrifugazione per separare le due attività nel surnatante resta solo attività di taglio del dsRNA Ipotesi di attività ribonucleasica della famiglia delle Rnase-III Exp. costrutti con epitopo tag T7 di fusione a RNAse (tipo 1-2-3) che funge da carrier, trasfezione in cellule S2 di Drosofila, immunoprecipitazione, 1 solo enzima che taglia dsRNA in frammenti di 21-23nt. L’ enzima viene chiamato DICER legato ad Rnase di tipo III. Mutante KO perde attività di interference. Omologhi di DICER in tutte le specie

Cosa è l’immunoprecipitazione La tecnica di immunoprecipitazione la dovreste conoscere, però in poche parole: Molti enzimi formano dei complessi oppure interagiscono con altri enzimi, proteine o DNA immunoprecipitazione con uno degli enzimi del complesso da studiare Si deve avere un buon anticorpo : non deve interagire col sito attivo che lega l’altro enzima Viene fatto l’estratto cellulare e si fa reagire con l’anticorpo contro la proteina, la precipitazione dell’anticorpo con la proteina fa da carrier per le altre proteine legate

Immunoprecipitazione e artefatti in breve I La tecnica ha molti rischi di carry-over Come si può fare per non precipitare artefatti Evidenze incrociate con altre tecniche Se la proteina che coprecipita è già nota è più facile dimostrare la sua identità con un anticorpo specifico Inversione dell’esperimento = col 2° ab si ripesca il 1°enzima Controlli con altri tipi di estratti e con condizioni diverse Stressare le condizioni di legame per eliminare legami aspecifici Per proteine nuove il rischio di vedere artefatti è più difficile da controllare

Imm.precipitazione con DNA* o RNA in breve II Immunoprecipitazione del DNA legato a fattori di trascrizione Anticorpo specifico (monoclonale, dovete sapere cosa è) Non deve alterare il sito di legame al DNA homeo box zip domain zinc finger Viene fissata la prot. al DNA precipitato e amplificato Si deve conoscere proteina (Ab) e sito di legame (PCR) Verifica del legame in vitro o in vivo *CHIP = chromosome immune-precipit.

Iterferenza exp in cellule Hela Cellule epiteliali di carcinoma umano della cervice Exp. trasfezione con siRNAs biotinilato co-immunoprecipitazione: coprecipita compl. enzimatico purificazione di 2 enzimi ≈100 kDa famiglia geni Argonauta (sviluppo Drosofila Ago1 e Ago2 interaz. con metab. RNA) Solo Ago 2 ha la capacità di taglio, gli altri legano piccoli RNA Topo transgenico per Ago2 non chiude il tubo neurale Attività Rnase, sito attivo con motivo DDE (aspart. glutam.) Identico ad Ago2 - due domini PIWI e PAZ sito PIWI taglia e PAZ lega mRNA (slicer activity) Mutazioni al sito DDE non tagliano

Più attività e funzioni di un sistema complesso Come viene scelta l’elica del dsRNA da processare ? quale elica lega RISC/Ago2 ? l’antisenso è meno stabile RISC avrebbe 2 attività come si libera la siRNA dal dsRNA ? Il complesso formato da Dicer-Ago2- siRNA con TRBP Nuova evidenza che RISC è complessato ad rRNA 80S (controlla i messaggeri per la traduzione) Negli oociti di Drosofila non c’è traduzione e nemmeno l’interferenza funziona Necessità di altro exp di conferma prossima diapo RISC = RNA interference (gene)-silencing complex TRBP = HIV transactivating response RNA binding protein

Exp traduzione - interference Sistema Iron = ferro Le proteine regolatrici del ferro IRPs in assenza di ferro legano siti specifici di risposta al ferro che stanno nei mRNA dei geni di controllo Iron e bloccano la traduzione impedendo ai fattori di inizio di legare l’mRNA Esperimento con reporter gene regolato con siti Iron L’attività RISC non richiede traduzione di mRNA RNA-induced gene-silencing complex (RISC) siRNAs contro il gene reporter: era attivo sia in presenza che assenza di ferro, indipendentemente che l’mRNA fosse tradotto o meno

Vettore per dsRNA palindrome In alternativa al primo vettore con GFP e lamina A/C costitutivo Vettori per il silenziamento di geni espressi con metodo piu’ efficace di quello dell’RNA antisenso. Paddison et al. PNAS 5 Feb. 2002 Clonaggio con inserimento di elementi fiancheggianti LoxP del fago P1 che tramite l’enzima CRE (ricombinasi) se gli elementi sono in palindrome produce una inversione dell’inserto, se gli elementi sono in tandem fa excidere ed integrare se c’e’ un solo elemento P GFP ZEO r L Gene per la resistenza alla zeocina; Le prime 500 bp codificanti di EGFP; Lox P; Promotore di citomegalovirus; pcDNA3

funzione del vettore per interferenza GFP ZEO r Ricombinasi CRE dsGFP CMV

Exp DICER + GFP (due negazioni affermano !) L’interferenza contro la GFP viene bloccata bloccando DICER con interferenza. Exp. very elegant Enzima Dicer siRNA (~ 21 - 20 nts) dsRNA (~ 500 bp) pGFP + 500ng dsRNA no dsRNA 1000ng dsRNA In vivo siRNA marker Control P19 siRNA P19 GFP Harpin ds FF ds Dicer Cellule trasfettate con pGFP e dsRNA di DICER o Firefly GFP Dimostrazione che è DICER a mediare l’interferenza P19 EC cells: cellule con il vettore stabilmente integrato.

2 modelli di interferenza: Modello 1 dicer TRBP Dicer taglia il ds RNA lungo in siRNA Ago2 Ago2 TRBP Formazione del complesso Ago2 + TRBP Corpi P di degradazione di mRNA Ago2 5’ degradato da exonucleasi 3’ finisce nei corpi P e Ago2 viene rilasciato di nuovo Il lungo RNA a doppio filamento è degradato da DICER che recluta Ago2 e TRBP. Ago2 taglia il piccolo siRNA che poi si associa al mRNA, viene tagliato in due frammenti, l’exisoma digerisce il frgm 5’, il frgm 3’ entra nel corpo P e la degradazione con Xrn1* rilascia Ago2 che nel citoplasma ricomincia il ciclo e si riassocia ad un altro complesso mRNA *Xrn1 = esonucleasi

modello di interferenza n.2 mRNA si associa nei corpi P tramite RCK (elicase) che permettono ad AGO2 e RISC di trovare il bersaglio di ibridazione con il siRNA, dopo l’ibridazione con il bersaglio l’ mRNA è tagliato ed i frammenti degradati all’interno del corpo P Inibizione della traduzione tramite RCK ribosoma Il ribosoma si disassembla Ago2 DICER e TRBP Digeriscono il dsRNA in siRNA

approfondimento PLoS Biol. 2006 Jun 13;4(7):e210 [Epub ahead of print] Links Translation Repression in Human Cells by MicroRNA-Induced Gene Silencing Requires RCK/p54. Articolo disponibile o-l sulla biblioteca bio-medica di TV Chu CY, Rana TM. Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, Massachusetts, United States of America. RNA interference is triggered by double-stranded RNA that is processed into small interfering RNAs (siRNAs) by Dicer enzyme. Endogenously, RNA interference triggers are created from small noncoding RNAs called microRNAs (miRNAs). RNA-induced silencing complexes (RISC) in human cells can be programmed by exogenously introduced siRNA or endogenously expressed miRNA. siRNA-programmed RISC (siRISC) silences expression by cleaving a perfectly complementary target mRNA, whereas miRNA-induced silencing complexes (miRISC) inhibits translation by binding imperfectly matched sequences in the 3' UTR of target mRNA. Both RISCs contain Argonaute2 (Ago2), which catalyzes target mRNA cleavage by siRISC and localizes to cytoplasmic mRNA processing bodies (P-bodies). Here, we show that RCK/p54, a DEAD box helicase, interacts with argonaute proteins, Ago1 and Ago2, in affinity-purified active siRISC or miRISC from human cells; directly interacts with Ago1 and Ago2 in vivo, facilitates formation of P-bodies, and is a general repressor of translation. Disrupting P-bodies by depleting Lsm1 did not affect RCK/p54 interactions with argonaute proteins and its function in miRNA-mediated translation repression. Depletion of RCK/p54 disrupted P-bodies and dispersed Ago2 throughout the cytoplasm but did not significantly affect siRNA-mediated RNA functions of RISC. Depleting RCK/p54 released general, miRNA-induced, and let-7-mediated translational repression. Therefore, we propose that translation repression is mediated by miRISC via RCK/p54 and its specificity is dictated by the miRNA sequence binding multiple copies of miRISC to complementary 3' UTR sites in the target mRNA. These studies also suggest that translation suppression by miRISC does not require P-body structures, and location of miRISC to P-bodies is the consequence of translation repression.

conclusioni ? Resta da capire se è valido il modello n.1 o n.2 Potrebbe venir proposto un altro modello alla luce di nuove evidenze che sconfessa quelli precedenti “ del doman non v’è certezza ” L. da Vinci  L. il Magnifico A. Poliziano L. Pulci ?