Clonaggio del DNA a che cosa serve avere dei frammenti di DNA specifici: -per poterlo analizzare piu’ facilmente isolatamente e non insieme a tutto il resto del DNA genomico della specie su cui si vuole lavorare -per avere delle sonde con cui andare ad isolare altri frammenti di DNA limitrofo non ancora noto -per poter poi fare delle mappe di restrizione, ossia delle mappe genetiche fisiche in cui c’e’ corrispondenza tra lunghezza dei frammenti e mappa, diversamente dalle mappe genetiche basate sulle frequenze di ricombinazione ottenute con gli incroci Dalle mappe genetiche in centimorgan alle mappe fisiche, i marcatori genetici comunque sono stati prima mappati e poi siè giunti ad una analisi sempre piu’ fine. La trasduzione è un sistema naturale con cui sono stati isolati frammenti di DNA batterico come in un clonaggio naturale. Negli organismi eucariotici e’ stata trovata presto l’omologia tra geni di specie diverse e cosi’ clonati geni delle specie anche lontane.

Clonaggio del DNA per poter clonare un frammento di DNA se ne devono conoscere alcune caratteristiche -si possono clonare frammenti che sfruttano l’omologia con dei frammenti gia’ clonati -oppure che hanno delle parti in comune con altre regioni di DNA note -il metodo piu’ingenuo e’ quello di partire da frammenti ignoti e da mappe cromosomiche trovarne la corrispondenza per poter avere dei marcatori molecolari. Nei procarioti e’ stato molto piu’ semplice andare ad identificare le regioni genetiche a cui corrispondono dei frammenti di DNA. La coniugazione batterica permette di avere dei merozigoti con cui si possono ottenere facilmente dei ricombinanti con i marcatori voluti, con l’aiuto anche di mappe di delezione si riescono ad individuare le regioni corrispondenti ai marcatori. Il fenomeno della trasduzione e’ il metodo naturale fisiologico del clonaggio di frammenti di DNA. L’uso di enzimi di restrizione e’ stato il passo successivo per arrivare alle mappe fisiche del DNA ed al clonaggio di frammenti di DNA.

Materiale necessario per clonare Enzimi di restrizione e ligasi (eventualmente DNAsi, terminal transferasi DNA polimerasi) Vettori per il clonaggio: plasmidi, fagi Tecniche di purificazione ed estrazione del DNA (inizialmente dopo la lisi cellulare si usava centrifugazione su gradienti di Cesio o altro) -ricordarsi l’esp. della semiconservativita’ della duplicaz. del DNA di Meselson e Stahl- Cosa significa clonare, da dove deriva la parola clone: in Microbiologia alla parola clone corrisponde una colonia batterica o un placca virale o fagica. Una colonia isolata su piastra Petri su terreno solido (agarizzato) deriva da una singola cellula e quindi omogenea dal punto di vista genetico, ogni cellula e’ geneticamente uguale alle altre. In una cultura liquida ci possono essere dei mutanti che si mescolano tra le altre cellule e quindi non essere perfettamente omogenea. - ricordarsi del test di fluttuazione di S.Luria e Max Delbrück - L’eccezione e’ data dal mosaicismo, evento raro.

Vettori: Plasmidi, Virus, Batteriofagi, Cromosomi artificiali plasmidi, sono i vettori piu’ semplici ed i primi ad esser stati utilizzati perche’ si replicano nei batteri e si purificano facilmente, sono presenti in molte copie nei batteri, la maggior parte deriva da colEI (plasmide di E.coli) - Inizialmente si usavano per il clonaggio i siti di restrizione naturali del plasmide, fino a quando sono state inserite delle mutazioni artificiali in una regione del plasmide che non provocava danni dal punto di vista funzionale del plasmide, i plasmidi possono portare la resistenza ad antibiotici (data da un enzima che li metabolizza come la b-lactamasi) che risultano utili per la selezione delle cellule trasformate col plasmide. - Introdurre i plasmidi in cellule batteriche si dice trasformare e cio’ avviene in cellule che hanno la capacita’ di assorbire DNA attraverso la membrana, impropriamente dette competenti,dopo trattamento con CaCl2 oppure con altri metodi come l’elettroporazione o shock termico. Nei plasmidi per utilita’ sono state introdotte varie modifiche: piu’ resistenze ad antibiotici, un sito multiplo di clonaggio e altre funzioni.

Strutture necessarie ed utili per un plasmide - origine di replicazione - resistenza ad un antibiotico o due (ampicillina, tetraciclina, canamicina, eritromicina, gentamicina, cloramfenicolo) - resistenza ad un secondo antibiotico eucariootico di mammifero - sito multiplo di clonaggio (multiple cloning site MCS) con la sequenza taglio unica per gli enzimi di rstrizione piu’ comuni (non ve ne sono altri in tutto il plasmide) - gene reporter (b-gal) nel MCS indicatore dell’efficienza di clonaggio per evidenziare colonie bianche e bleu (X-gal, IPTG) Tipi di vettori: per clonaggio e sottoclonaggi, per librerie genomiche, per cDNA, per espressione

Analisi con enzimi di restrizione: Gli enzimi di rewstrizione tagliano qualunque DNA in corrispondenza di sequenze specifiche. Per esempio: BamHI G’GATCC Bgl II A’GATCT Eco RI G’AATTC Hind III A’AGCTT Kpn I GGTAC’C Pst I CTGCA’G Sma I GGG’CCC Hae IIII GG’CC Ecor RV GAT’ATC alcuni tagliano al centro della sequenza palindromica del sito di restrizione (EcoRV, Hae,Sma) altri al 5’(Bam,Bgl,EcoRI,Hind) ed altri al 3’(Kpn, Pst) Come conseguenza di questo le estremita’ del taglio sono pareggiate quando il taglio e’ centrale, altrimenti sporgono al 5’ o al 3’.

Clonaggio costituito di varie fasi: Estrazione del DNA (sia plasmidico che genomico da clonare) digestione o amplificazione (per PCR) Ligasi tra i DNA dell’ inserto e del plasmide Trasformazione batterica o di cellule eucariotiche o impacchettamento dei fagi l o M13 (per estrusione) con helper Selezione dei batteri per la resistenza all’antibiotico (ampicillina) o altri per cellule eucariotiche, per i fagi selez. per vitalita’ Individuazione (screening) dei batteri con plasmide ricombinante con gene indicatore (lac z: blue/binaco) Estrazione del DNA plasmidico trasformante (mini-midi-maxi prep)

Tipi di clonaggio La b-elica del DNA e’ doppia, ognuna orientata col verso 5’ 3’ (con la numerazione degli atomi di carbonio del desossiribosio) che e’ il verso della sintesi per opera delle polimerasi sia del DNA che dell’ RNA 5’ protruding (sporgenti) Hind III NNNA AGCTTNNN NNNT TCGA ANNN 3’ 5’ NNNA 3’ 5’ AGCTTNNN NNNT TCGA 5’ 3’ ANNN 5’ 3’ 3’ protruding Kpn I NNNGGTAC CNNN NNNGGTAC 3’ 5’CNNN NNNC CATGGNNN NNNC 5’ 3’CATGNNN 5’ 3’ 3’ 5’ blunt ends (lisce, piatte) SmaI NNNCCC 3’ 5’GGGNNN NNNGGG 5’ 3’CCCNNN

Gli estremi dei frammenti di DNA ottenuti con degli enzimi di restrizione possono quindi essere utilizzati per clonare ; la digestione del DNA deve essere controllata, alcuni enzimi sono sensibili e quindi inattivi se trovano delle basi metilate nella sequenza specifica di taglio. Si possono scegliere strategie diverse di clonaggio: lo stesso sito di restrizione, uso di enzimi “isoschizomeri” che hanno lo stesso sito di taglio o parte di esso come BamHI e Sau3A nnnG GATCC nnn nnn GATCnnnn nnn CCTAG Gnnn nnn CTAG nnnn oppure siti di taglio ad estremita’ lisce (piatte) come SmaI, alle quali si possono attaccare altre estremita’ lisce senza ricreare il sito di restrizione oppure conservandolo Un sito di restrizione “protruding” puo’ essere reso liscio con una exonucleasi o con una polimerasi togliendo o aggiungendo le basi mancanti. Per clonare freammenti prodotti da PCR a seconda delle polimerasi si possono avere estremita’ lisce o “protruding”

I vettori : Vettori di clonaggio: plasmidi, cosmidi e fagi - per sequenziamento: con elementi per avere singolo filamento di DNA per clonare sonde ottenendo l’inserto a singolo filamento a DNAo RNA - i vettori di espressione in procarioti ed eucarioti (shuttle) recentemente con possibilita’ di espressione controllata - per studiare l’attivita’di promotori ed enhancers con geni reporter: lac-z (b gal), CAT assay, luciferasi, GFP, Con promotore costitutivo o inducibile (SV-40, CMV, HS Tk ecc.) In fusione con un gene reporter al 5’ o al 3’ poly istidine (Invitrogen) glutatione trasferasi (GST) pGEX Sistema per studiare interazione tra proteine: il doppio ibrido, sorta di complementazione, Two hybrid vectors system (se ne parla a parte)

CORSO DI BIOLOGIA APPLICATA E PRINCIPI DI GENOMICA A.A. 2007 BU Prof. Domenico Frezza Lezione N.2

A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??  a creare ‘copie identiche’ (= CLONI) di un frammento di DNA DIFFERENZE con la PCR: è una reazione in vivo sfrutta l’apparato di replicazione del DNA delle cellule batteriche si fanno duplicare le cellule non necessita nessuna conoscenza a priori della sequenza del frammento di DNA da clonare non si usano primers è un processo più accurato le copie di DNA ottenute sono esattamente identiche l’una all’altra sistemi di ‘correzione degli errori’ cellulari

-per analizzarlo più facilmente isolatamente e non con tutto il resto del DNA genomico della specie su cui si vuole lavorare; -per avere delle sonde con cui andare ad isolare altri frammenti di DNA limitrofo non ancora noto; -per fare delle mappe di restrizione, ossia delle mappe genetiche fisiche in cui c’è corrispondenza tra lunghezza dei frammenti e mappa. A CHE COSA SERVE AVERE DEI FRAMMENTI DI DNA SPECIFICI? ?

TRAMITE il CLONAGGIO  individuare nuovi geni da sequenziare  librerie geniche stabilire quali geni sono espressi in ogni tipo cellulare  librerie di cDNA produzione di molecole ricombinanti  vettori di espressione (es. insulina umana)

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? PREMESSE: 1) I BATTERI CELLULE PROCARIOTICHE: assenza nucleo singola molecola circolare di DNA (3-4 M bp) nel citoplasma possono acquisire facilmente piccole molecole di DNA esogeno 2) I PLASMIDI piccole molecole circolari di DNA (3000-4000 bp) che portano pochi geni  possono facilmente essere acquisiti dalle cellule batteriche

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? PREMESSE: 3) GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE Estremità piatte o blunt Estremità coesive o sticky ENDONUCLEASI che tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze di basi COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? Il DNA da clonare viene tagliato con un enzima di restrizione ENZIMA di RESTRIZIONE inserito in un plasmide tagliato con lo stesso enzima LIGASI - TOPOISOMERASI PLASMIDE PLASMIDE RICOMBINANTE ad opera della LIGASI o della TOPOISOMERASI CELLULA BATTERICA Il PLASMIDE RICOMBINATE viene inserito in una cellula batterica e al suo interno si duplica

PUO’ SUCCEDERE CHE… La cellula non acquisisce il plasmide e quindi neanche il DNA da clonare 2) Il plasmide si richiude su se stesso senza acquisire il DNA da clonare la cellula acquisisce il plasmide ma NON il DNA da clonare STRATEGIE per VERIFICARE che il CLONAGGIO è AVVENUTO: 1) Il plasmide contiene un gene che conferisce alla cellula la resistenza ad un antibiotico le cellule vengono fatte crescere (e duplicare) in un terreno selettivo contente quell’antibiotico: SOLO le CELLULE CONTENENTI il PLASMIDE POSSONO DUPLICARSI nel terreno contenete l’antibiotico 2) Il DNA da clonare viene inserito all’interno di un gene che codifica per un enzima (che compie una determinata reazione metabolica) impedendo la sintesi di tale enzima  le CELLULE CONTENENTI il PRODOTTO della REAZIONE CATALIZZATA dall’ENZIMA NON CONTENGONO il DNA CLONATO

UN ESEMPIO: il TOPO-TA Cloning il plasmide è tagliato in un sito che lascia delle estremità coesive di Timina mentre al frammento da clonare sono aggiunte delle estremità coesive di Adenina il legame tra plasimde e DNA da clonare è fatto dall’enzima Topoisomerasi il plasmide porta i geni per la resistenza agli antibiotici ampicillina e kanamicina il sito di inserzione del DNA da clonare spezza la sequenza del gene lacZ (-galattosidasi)

La -GALATTOSIDASI e l’X-gal L’ X-gal è un omologo del galattosio che viene scisso dalla -galattosidasi in due prodotti uno dei quali è di colore blu intenso La -galattosidasi è un enzima coivolto nella prima tappa del metabolismo del galattosio le cellule in cui viene sintetizzata la -galattosidasi (il frammento da clonare non si è inserito) appaiono di colore BLU le cellule senza -galattosidasi (il frammento da clonare si è inserito) appaiono di colore BIANCO

IN PRATICA: Le FASI deL CLONAGGIO Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita Preparazione del DNA da clonare  purificazione  creazione delle estremità coesive o “blunt” Inserzione del DNA da clonare nel plasmide Inserzione del plasmide nelle cellule batteriche  trasformazione Piastramento delle cellule e crescita Recupero degli inserti o ampliconi se si usa PCR