CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) sara.caldarola@uniroma2.it ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00

ANIMALI TRANSGENICI : definizione Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

VETTORI RETROVIRALI Permettono il trasferimento e l’integrazione di materiale genetico nella cellula ospite

Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

Possibile effetto citopatico VETTORI VIRALI Vettore virale Vantaggi Svantaggi Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di manipolazione del genoma virale Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in divisione Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante Possibile effetto citopatico Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento Difficoltà di controllare le linee cellulari

Ciclo vitale di un retrovirus • genoma a RNA, 2 copie • L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. • Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. • L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. • 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

Genoma retrovirale Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb Trascrittasi inversa e integrasi Proteina strutturale capside Proteina per involucro Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Lunga sequenza terminale ripetuta Vettore retrovirale Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE Lunghezza massima: 8Kb

INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR) Infettano facilmente cellule in attiva replicazione Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA E PRODUZIONE GENE X

Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Utilizzo vettori retrovirali: TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: • Correggere un difetto genetico • Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA • Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). • Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. • Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno. • Amministrabile direttamente nel paziente. • In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Ben tollerato. • Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. • Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

2) MICROINIEZIONE del DNA Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35) Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono microiniettati con DNA lineare contenente il transgene (circa 200 copie) all’interno del pronucleo maschile Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi. Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione è nella linea somatica o germinale

Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Al max 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica!!!

GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

2) Cellule staminali embrionali (ES cells) Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

Integrazione Sito specifica RICOMBINAZIONE OMOLOGA CALCIO FOSFATO Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule LIPOSOMI Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana Integrazione Sito specifica RICOMBINAZIONE OMOLOGA ELETTROPORAZIONE Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando “buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA PCR

SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio TRANSGENE di interesse Gene che conferisce resistenza alla G418 Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA ASPECIFICA SPECIFICA Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

PCR SPECIFICA ASPECIFICA

Il GENE TRAPPING 1) Consente l’isolamento di nuovi geni 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato 3) È mutagenico: produce knockout X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

STRATEGIA DEL GENE TRAP Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento Selezione dei cloni tramite “marker” Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato ANALISI DEL FENOTIPO

ELEMENTI necessari per gene trap: Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo “Entrapment vector” contenente : - gene reporter - marker di selezione

Cellule staminali embrionali di Topo Integrazione Sito specifica SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto

Geni reporter The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal) The firefly luciferase gene The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene “Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

per espressione di un gene e Elementi importanti per espressione di un gene e utilizzati per il GENE TRAPPING Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale di un promotore Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene

Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING Enhancer trap Vector Promoter trap V. Gene trap V.

Enhancer Trap Vector neo neo neo Endogenous gene X P' lac Z Promotore Promotore e pA INDIPENDENTI P' lac Z neo Promotore MINIMO pA pA Exon 1 Exon 2 Exon 3 Enhancer Vector Integration DNA lac Z Promotore MINIMO neo lac Z neo RNA protein PROTEIN X β-gal NeoR

Promoter Trap Vector lac Z neo lac Z neo neo lac Z Endogenous gene X Promotore e pA INDIPENDENTI PROMOTORE Promotore ASSENTE P' lac Z neo pA pA Vector Integration DNA lac Z neo RNA neo lac Z protein PROTEIN X β-gal NeoR

Gene Trap Vector SA SA lac Z neo SA lac Z neo lac Z neo NeoR Promotore e pA INDIPENDENTI Endogenous gene X Promotore ASSENTE P' lac Z neo SA pA pA Introne gene X Vector Integration lac Z neo DNA SA Spliced transcript lac Z neo RNA SA protein PROTEIN X NeoR β-gal Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

RICAPITOLANDO………….. Il GENE TRAPPPING consente Identificazione NUOVI GENI Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI