DROSOPHILA

Ciclo vitale La drosophila ha un ciclo vitale 3mm rapido 0,5mm 4d 1d Fecondazione/embriogenesi 3d 1d 1d 1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd. La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana.

La Drosophila è un ottimo sistema modello: Ha un ciclo vitale rapido e produttivo Animale piccolo, facile da sfamare e da crescere (molti individui in poco spazio) “Piccolo genoma”: 105 Mb (5% genoma umano 4 cromosomi (2 autosomi + X + piccolo) 14.000 geni 100 anni di genetica 75% geni umani identificati in Drosophila MA…….. 1) I ceppi non possono essere congelati. Richiesta di coltura continua. 2) Non è possibile effettuare RICOMBINAZIONE OMOLOGA (no gene targeting)

METODI PER CREARE DROSOPHILA MUTANTE (TRANSGENICA) RAGGI IONIZZANTI (raggi X): • SI: produzione di rotture cromosomiche visibili. Facile identificazione del gene • NO: mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto 1/1000 MUTAGENESI CHIMICA (EMS etc.) • SI: mutagenesi di singole basi del genoma • NO: difficili da localizzare 1/10000 MUTAGENESI mediata dai TRASPOSONI (P-elements etc.) • SI: singolo evento facile da localizzare (gene reporter) • NO: non random. Solo alcuni geni sono bersaglio.

Elementi mobili in Drosophila Il 15% del genoma di Drosophila è MOBILE Esistono 80 tipi differenti di ELEMENTI TRASPONIBILI Lunghezza tra 50-10.000bp (media 5Kb) Da 1 a 1000 copie nel genoma (circa 50/genoma) Molti sono specie specifici ELEMENTO COPIA ELEMENTO P: elemento mobile del genoma. lunghezza variabile tra 500-2900 bp Aggiunta RECENTISSIMA nel genoma di Drosophila Melanogaster Studi del 1992 hanno osservato che gli elementi P provengono da un’altra specie che ha “contaminato” la D.m. intorno al 1950.

L’elemento P

L’elemento P Gli elementi P si muovono mediante un meccanismo di COPIA e INCOLLA Gli elementi P sono presenti sui cromosomi di TUTTI I TESSUTI ma LA TRASPOSASI E’ ATTIVA SOLO NELLE CELLULE GERMINALI STOP ORF0-ORF1-ORF2 ORF0-ORF1-ORF2-ORF3 http://www.oup.co.uk/best.textbooks/

L’elemento P Tutto ciò che è all’interno delle seq ripetute In presenza della TRASPOSASI, qualsiasi frammento di DNA posto tra le regioni terminali invertite puo’ essere MOBILIZZATO Tutto ciò che è all’interno delle seq ripetute viene mobilizzato L’elemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5’-3’ del gene ospite o tende ad inserirsi nelle vicinanze di altri elementi P ed ha una leggera preferenza per sequenze target GGCCAGAC CEPPO di DROSOPHILA con elemento P (circa 30-50 copie): ceppo P CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI

Disgenesi degli Ibridi Incapacità di certi ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo Produttivo poiché generano ibridi sterili (benché fenotipicamente simili) Gli IBRIDI generati da questi incroci sono DISGENICI: Aberrazioni cromosomiche Mutazioni Sterilità Alterata segregazione alla meiosi

Disgenesi degli Ibridi è ASIMMETRICA L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI CEPPO di DROSOPHILA con elemento P: ceppo P CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M http://www.oup.co.uk/best.textbooks/

LA TRASPOSASI E’ ATTIVA Disgenesi degli Ibridi LA TRASPOSASI E’ ATTIVA SOLO NELLE CELLULE GERMINALI (splicing) Nel citoplasma delle UOVA di ceppo P Elevati livelli di repressore Riarrangiamenti cromosomici STERILITA’ Nel citoplasma delle UOVA di ceppo M NO Repressore SI Trasposasi

Elemento P come vettore per il trasferimento genico PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P + TRASPOSASI Elemento P come vettore per il trasferimento genico Spradling and Rubin (Science 1982) sviluppano un sistema per l’integrazione delle sequenze clonate nell’elemento P nei cromosomi della linea germinale

PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P PLASMIDE DONATORE: transgene di interesse (tra seq ripetute invertite 5’P-3’P) gene reporter (LacZ) Gene marker (wt+ occhi rossi) PLASMIDE conTRASPOSASI: Codifica per trasposasi Sequenza ripetuta 5’p difettiva TRASPOSASI INATTIVA Embrione wt -/- Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce DNA esogeno entra in alcune cellule Nelle cellule della linea germinale: elemento P TRASPONIBILE

PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P

ROSY - ROSY - ROSY + ROSY - ROSY +

DROSOPHILA TRANSGENICA “ENHANCER TRAP” 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI

TECNICA dell’ENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer. Tecnica utilizzata per: Identificazione di nuovi geni Analisi dell’espressione di geni tempo/tessuto specifici 3) Permette analisi molti geni simultaneamente

TECNICA dell’ENHANCER TRAP A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4 A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.

A) Enhancer TRAP P(LacZ)

LINEE “ENHANCER TRAP” a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di oltre 4000 ceppi b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di espressione

B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence) Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni LIEVITO DROSOPHILA

2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO GAL4/UAS  SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Collezione di ceppi di Drosophila Promotore UBIQUITARIO Promotore SPECIFICO (spazio) Promotore Temp-SENS (tempo) IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica PROMOTORE Tessuto specifico ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO GAL4/UAS  SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI SPAZIO TEMPO

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI WT MUTATO DELETO antisenso WT UAS/Cbl oncogene

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

Studio del PROMOTORE Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione L’attività della betagalattosidasi permette di identificare La regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

Studio del PROMOTORE Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

embrione

cervello

intestino ghiandole salivari