SVILUPPO DI UN IMMUNOSENSORE PER LA DETERMINAZIONE DEL 17- ESTRADIOLO NEL SIERO BOVINO G. Fares, G. Volpe, D. Moscone, R. Draisci*, F. delli Quadri*, L. Achene*, G. Palleschi. Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di Roma Tor Vergata, Via della Ricerca Scientifica, 00133 Roma. * Lab. Medicina Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, V.le Regina Elena 299, 00161 Roma. INTRODUZIONE Il 17-estradiolo (17-E2) è un ormone steroideo naturale con attività estrogenica, usato per curare e prevenire infezioni animali. Tale sostanza, date le sue proprietà anabolizzanti, viene anche illegalmente utilizzata come promotore di crescita negli allevamenti intensivi degli animali di azienda. A causa dei suoi effetti carcinogenici, l’Unione Europea ha bandito il suo utilizzo a scopo di ingrasso per proteggere il consumatore da possibili effetti dannosi dovuti al consumo di carne contaminata. Conseguentemente, in Italia, è stato stabilito un limite massimo per il 17-E2 (40 pg/ml tranne per animali gravidi) nel siero e nel plasma bovino. Da qui l’esigenza di disporre di metodi di analisi, semplici e rapidi, per accertare l’eventuale presenza dell’ormone nei fluidi biologici. Questo lavoro è focalizzato sulla realizzazione di un immunosensore elettrochimico monouso per la determinazione del 17-E2 nel siero bovino. Lo schema del saggio sviluppato è di tipo competitivo diretto Fig.1. Allo scopo di ottenere una superficie altamente selettiva per l’analita e ridurre allo stesso tempo l’adsorbimento aspecifico da parte di altre molecole, è stato utilizzato il metodo del precoating che prevede l’adsorbimento sulla fase solida (superficie elettrodica) di IgG aspecifiche, seguito dal loro legame con gli anticorpi specifici per l’analita da dosare. Le successive fasi ottimizzate consistevano nella incubazione della soluzione di competizione, contenente estradiolo libero e estradiolo coniugato (appositamente sintetizzato) con l’enzima fosfatasi alcalina (AP) e nella rilevazione dell’-naftolo, prodotto della reazione tra l’enzima e il substrato -naftil fosfato, mediante voltammetria differenziale ad impulsi (DPV). PRINCIPIO DEL METODO La tecnologia degli “screen printed”(SPEs), elettrodi stampati ottenuti tramite serigrafia, consente la realizzazione di sistemi di rilevazione miniaturizzati, prodotti su larga scala ed a basso costo. La loro economicità permette di utilizzarli come “usa e getta”, eliminando di conseguenza fenomeni di avvelenamento della superficie elettrodica, e li rende adatti per misure in “situ”. 3 2 1 1. Elettrodo di Riferimento di Ag 2. Elettrodo di Lavoro di grafite 3. Controelettrodo di Ag  Come è fatto uno SPE?  Funzione di un SPE Trasduttore di segnale Supporto per l’immobilizzazione del biocomponente L’immunosensore realizzato prevede che l’interazione tra i biocomponenti avvenga direttamente sulla superficie dell’elettrodo di grafite stampato (elettrodo di lavoro). IgG aspecifiche Anticorpo specifico per il 17-E2 17-E2 -AP 17-E2 Fig. 1 RISULTATI velocità di scansione:100 mV/s frequenza degli impulsi di potenziale: 0.16 sec intervallo di potenziale: 0 - 600 mV durata dell’impulso: 60 ms ampiezza dell’impulso (DE): 50 mV Parametri ottimizzati per l’-naftolo Current (mA) E (mV) Risposta degli elettrodi SPEs a differenti a concentrazioni di -naftolo Voltammetria ad impulso differenziale (DPV) “Binding steps” 4 µL 17-E2 -AP (differenti diluizioni), 25 min. precoating: 8 µL IgG aspecifiche (10µg/mL), “overnight” 4 oC coating: 8 µL Pab (1:100), 1h 4 µL tampone di lavoro (PBS), 5 min. 50 µL 1-naftilfosfato, 2 min Curva di binding del 17-E2 -AP tra tutti gli steps menzionati, venivano effettuati 2 rapidi lavaggi con PBS addizionato con Tween (0.05%) Immunosensore Allo scopo di ottimizzare la quantità di 17-E2 -AP, da utilizzare nella successiva competizione, sono state costruite delle curve di “binding” fissando la concentrazione dell’anticorpo specifico (Pab) per il 17-E2 e variando quella del coniugato secondo lo schema: “Competition steps” 4 µL 17-E2 -AP (1:150), 25 min. precoating: 8 µL IgG aspecifiche (10µg/mL),“overnight” 4 oC 4 µL 17-E2 (soluzioni standard), 5 min. Curva standard del 17-E2 La sperimentazione futura consisterà nel testare le “performance” dell’immunosensore sviluppato su un siero “bianco” fortificato con differenti concentrazioni di17-E2 e nell’analisi di campioni reali; i risultati verranno confrontati con quelli ottenuti mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS-MS). la diluizione di 17-E2 -AP = 1:150 (punto di flesso della curva ) è stata selezionata per la succesiva competizione: