Corso di ingegneria genetica Possibile programma Corso di ingegneria genetica finalità dell’Ingegneria genetica applicazioni di metodologie per lo studio della genetica : metodi e tecniche per lo studio della struttura metodi e tecniche per lo studio di funzione la struttura necessaria per svolgere la funzione interpretazione della struttura per la funzione del GENOMA che cosa è un metodo sperimentale, validazione tramite uso dei controlli adeguati

Programma I Definizione: non fa parte della bio-genetica (sapete cosa sia la biogenetica? ) Scopi : non per studiare la bio-genetica, ma la genetica, la genetica dello sviluppo, il genoma, l’evoluzione, l’espressione genica, rapporto fenotipo/genotipo In 2 parole : struttura e funzione dei genomi Uso del DNA “RICOMBINANTE” non derivato da “crossing-over” Cosa si deve sapere: - cosa sono le mappe genetiche - enzimi di restrizione - cosa è un gene - regolazione dei geni - analisi di mappa tramite Southern b. - analisi dell’espressione tramite Northern b. - anticorpi monoclonali, ELISA, Western b.

Programma II Cosa vuol dire clonare, perché si clona Differenza tra clonaggio di cellule e clonaggio di sequenze di DNA, l’RNA non si clona direttamente. vettori di clonaggio, sono diversi per gli scopi per cui si usano, possono essere adattati: - strutture dei vettori - vettori per sequenziamento o subclonaggio - vettori per espressione - vettori combinati per trasfezione in cellule eucariotiche (uso di geni reporter) Analisi diretta sul DNA tramite PCR - amplificazione del DNA da qualunque (quasi) materiale biologico

Programma III Manipolazione degli acidi nucleici Analisi in Silicio, in vitro, in vivo in silicio: cercare sequenze di DNA in banca dati: per analogia, per funzione, per specie e fila, per identità banche dati per categorie: genomiche, EST, cDNA, micro RNA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov uso di parole chiave Dal “silicio” al “vitro”: in vitro veritas Tecnica universalmente più diffusa : PCR

Programma IV Cosa è la PCR : scelta sequenza ampliconi, primers, condizioni Come funziona (amplificazione) Come e dove si applica, a cosa si applica, con quali scopi Come per altre tecniche applicazioni per lo studio di struttura applicazioni per studi di funzione Struttura e regolazione del genoma < sistema bidirezionale > La struttura regola ed è regolata Diverse vie di regolazione: modello Jacob-Monod “genomica e post genomica” : nuovi modelli compatibili, strutturistica

Programma V Quali varianti della PCR ci possono essere PCR - quantitativa, Real time, diagnostica (microbiologia) - semiquantitativa competitiva, Real time RT-PCR RT = reverse transcriptase, diversa da RT-PCR intesa come PCR (real time) Nested PCR R.A.C.E. AFLP PCR per studiare polimorfismi (foot-printing) ≠ da SNPS CHIP chromosome immune precipitation PCR per mutagenesi = costruzione di sequenze mutate inserzioni delezioni sostituzioni

Programma VI I controlli per la verifica sperimentale Preparazione dei protocolli sperimentali Procedure controllate Che vuol dire controllo A che servono Come si fanno Si devono fare per ogni tecnica sperimentale (ripetibile)

Programma VII Studio in vitro ed in vivo, stessi approcci: Metodi e applicazioni per il blocco di funzione Metodi e applicazioni per stimolazione di funzione Blocco di funzioni “cis” strutturale Blocco di funzione “trans” codificante Metodi con interruzione diretta o con interferenza indiretta Vettori per ottenere questi obbiettivi

Programma VIII Vettori per studi in vitro Vettori per studi cellulari in vivo: diversi tipi di promotori costitutivi, inducibili, tessuto specifici; Vettori per organismi transgenici Stesse finalità per tutti : inattivazione di funzione stimolazione di funzione

Programma IX Espressione e trascrizione inattivazione tramite : RNA, interference, PNA (peptide nucleic acids), Ricombinazione omologa e knock-out di funzione Ricerca dei fattori che legano e interagiscono con gli Acidi nucleici (EMSA, CHIPS) con altre proteine (doppio ibrido con vettori specifici)

Programma X Organismi transgenici Inserimento di nuove funzioni Blocco di funzioni endogene Diversi tipi di vettori i diversi tipi di transgenia Uso dei diversi modelli animali: Modelli murini, Vari tipi di transgenia : diretta e con cellule staminali embrionali Cosa si può studiare con i topi transgenici scopo di ogni tipo di topo transgenico, applicazioni con obbiettivi diversi (espressione, K.O. > gene trap)

Programma XI Dalla genomica approcci globali, olistici Conoscenza globale del genoma di animali modello di animali commerciali Analisi della struttura per interpretare la funzione EMSA, CHIP, Chips Ripensamento sul DNA non codificante Funzioni del DNA non codificante (mantenimento e variabilità) importanza dei polimorfismi uso dei polimorfismi, come si studiano e perchè Tipi di DNA non codificanti, studio delle modificazioni epigenetiche

Programma XII Avete trovato elementi contraddittori con la teoria Evoluzionistica Darwiniana, Ci sono elementi per sostenere ipotesi Lamarkiane In che maniera l’ambiente influenza e modifica il genoma Come si può studiare Fenomeni epigenetici confliggono con i postulati ?