UTILIZZO di PIANTE TRANSGENICHE Piante RESISTENTI agli INSETTI e INSETTICIDI Piante RESISTENTI a VIRUS Piante RESISTENTI agli ERBICIDI Piante RESISTENTI a FUNGHI e BATTERI Piante per MODIFICARE SAPORE-COLORE-MATURAZIONE-FERTILITA’

PIANTE resistenti a INSETTI Piante transgeniche che esprimono PROTOSSINA INSETTICIDA di Bt 2) Piante transgeniche che producono INIBITORI di amilasi e proteasi

Piante che esprimono PROTOSSINA INSETTICIDA di Bt DIFFUSIONE DELLA PROTOSSINA SULLE COLTURE: La protossina di B. thuringiensis non permane nell’ambiente e non è pericolosa per gli animali quindi può essere utilizzata per irrorare le piante. (1938) PRODUZIONE DI PIANTE CON PROTOSSINA: Contro quegli insetti che attaccano i tessuti interni delle piante, si possono generare piante che esprimono i geni delle tossine di B. thuringiensis. Finora sono state prodotte diverse piante che esprimono il gene della prototossina di B. thuringiensis (pomodoro, tabacco, patata, riso, mais, melo,melanzana, pioppo, noce, abete, mirtillo e cotone) (1996)

CHI E’ IL BACILLO THURINGIENSIS?? (BT)   Identificato nel 1902 nella larva del baco da seta da Ishiwata Produce una tossina che danneggia l’apparato digerente delle larve di Ditteri (zanzare) o causa nei bruchi di molti Lepidotteri una malattia paralitica.

MECCANISMO di AZIONE di Bacillus T. Colpisce solo le LARVE protossina Bt ha 2 classi di TOSSINE: (Cyt) CITOLISINE tossiche per Coleotteri (scarafaggi) e Ditteri (zanzare-mosche) 2) (Cry) DELTA-ENDOTOSSINE tossiche per Lepidotteri (farfalle e falene) legano recettori specifici di membrana delle cellule dell’intestino dell’insetto uccidendole

PRODUZIONE di PIANTE Bt Promotore FORTE Virus del mosaico del cavolfiore Nopalina-sintasi METODO VETTORE COINTEGRATO

PRODUZIONE di PIANTE Bt PER AUMENTARE ESPRESSIONE DELLA TOSSINA: Delezione della regione C-term. Clonaggio della regiona N-term (regione CATALITICA) Mutazione sito specifica di seq. note per inibire trascrizione/traduzione (96,5%) Mutazione ampie regioni: codoni procariotici-strutture II Mrna Espressione solo nel Cloroplasto – proteina di fusione (tossina+prot trasportatrice) - solo tossina (bombardamento + seq omologhe) In questo caso non è necessario mutare la seq con codoni “procariotici” poiché il Cloroplasto è di origine procariotica.

rischio di SELEZIONE di insetti resistenti RISULTATI Pianta WT Pianta Bt RISCHIO: selezione di insetti RESISTENTI alla TOSSINA Bt!! Soluzione: espressione inducibile di Bt nel tempo. Utilizzo del promotore PR-1A Promotore di un gene del tabacco indotto da patogeni e sostanze chimiche (acido salicilico) In questo modo è possibile esprimere la Tossina solamente in determinati periodi dell’anno riducendo il rischio di SELEZIONE di insetti resistenti

Piante transgeniche che producono INIBITORI di amilasi e proteasi Per causare la morte degli insetti dannosi per la pianta, sono state prodotte piante transgeniche capaci di esprimere sostanze che non permettono la digestione del vegetale negli insetti. Queste sostanze interferiscono con l’idrolisi delle proteine vegetali (PROTEASI) o dell’amido (AMILASI) Questo causa la morte degli insetti per fame.

+ Piante transgeniche che producono INIBITORI di proteasi Produzione di Tabacco transgenico resistente agli insetti L’espressione dell’inibitore potrebbe essere circoscritta alle foglie/radici (enhancer-trap) + METODO VETTORE BINARIO Gene inibitore della TRIPSINA (proteasi) di Vigna sinensis

Piante transgeniche che producono INIBITORI di proteasi Produzione di Riso transgenico resistente agli insetti (Sesamia inferens) 80% delle piante transgeniche risulta resistente METODO BOMBARDAMENTO Conferisce resistenza nei confronti dell’erbicida “basta” (glufosinato di ammonio) Gene inibitore II della proteinasi (proteasi) di Patata

PIANTE resistenti a VIRUS I virus delle piante causano spesso danni considerevoli alle coltivazioni. I trattamenti chimici spesso sono inefficaci: produzione di piante transgeniche capaci di esprimere il gene per la RESISTENZA al VIRUS (esistenti in natura in altre piante) Ma spesso piante resistenti cosi’ prodotte diventano nuovamente sensibili Sono state prodotto piante transgeniche esprimenti PROTEINE DI RIVESTIMENTO DEL CAPSIDE VIRALE Queste piante transgeniche (meccanismo sconosciuto) sono piu’ resistenti a successive infezioni virali (IMMUNIZZAZIONE) ANTISENSO dell’RNA per le PROTEINE DEL CAPSIDE VIRALE Durante infezione, RNA antisenso si appaia all’RNA virale non permettendone la traduzione (RNA ANTISENSO)

del virus del mosaico del cetriolo RNA4=proteina CAPSIDE del virus del mosaico del cetriolo IMMUNIZZAZIONE RNA antisenso

VETTORI BINARI EFFICACE ad EFFICACE solo a ALTE DOSI di VIRUS IMMUNIZZAZIONE RNA antisenso VETTORI BINARI EFFICACE ad ALTE DOSI di VIRUS EFFICACE solo a BASSE DOSI di VIRUS

RNA4 VIRUS

PIANTE resistenti a VIRUS multipli VETTORI BINARI Confine DESTRO/SINISTRO Virus mosaico cetriolo Virus 2 mosaico anguria Virus mosaico giallo zucchine

PIANTE resistenti a ERBICIDI Resistenza agli erbicidi Può essere acquisita in vari modi: 1) Conferire alla pianta la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida 2) Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all’erbicida, così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante l’erbicida

Conferire alla pianta la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida 1) Il bromossinile è un erbicida che agisce inibendo la fotosintesi. La nitrilasi è un enzima isolato da Klebsiella ozaenae (batterio) che inattiva il bromossinile, è stato clonato nelle piante che diventano così resistenti all’azione dell’erbicida. 2) Il glifosato è un erbicida che agisce inibendo la biosintesi degli amminoacidi aromatici delle piante. E’ stato isolato un ceppo di E.coli resistente al glifosato. Il gene che conferisce la resistenza (EPSPS) è stato clonato e posto sotto un Pr e Term Vegetale. Sono state cosi’ prodotte piante (pomodoro, tabacco cotone) resistenti al glifosato.

TRANSGENI (PIANTE) piu’ utilizzati nel MONDO Mais Bt Resistenza alla PIRALIDE (Lepidottero) Mais Starlink Resistenza a ERBICIDI

PIANTE resistenti a FUNGHI e BATTERI FUNGHI: Le piante infettate dai funghi sintetizzano un gruppo di proteine correlate con la patogenesi (PR). Sono state modificate piante come il riso ed il tabacco in modo da produrre costitutivamente alcune di queste proteine, quali ad es. la chitinasi capace di degradare la parete dei funghi BATTERI: Per rendere le pianti resistenti all'infezione batterica è stato introdotto nelle piante il gene per il lisozima del batteriofago T4, capace di lisare batteri sia gram-positivi che gram-negativi. Tali piante hanno dimostrato resistenza verso elevate concentrazione di batteri patogeni. BOMBARDAMENTO di PROTOPLASTI di RISO

Modificazione del COLORE del fiore Tecniche di incrocio naturale hanno permesso di produrre nuove varietà e di variare la pigmentazione dei fiori. L’incrocio tradizionale è pero’ una procedura lenta e faticosa e circoscritta al patrimonio genetico di quella particolare specie. Con PIANTE TRANSGENICHE si puo’ manipolare il percorso biosintetico delle ANTOCIANINE

ANTOCIANINE: classe di FLAVONOIDI responsabili del COLORE del FIORE Sono sintetizzate a partire da FENILALANINA Le catene laterali del prodotto finale determinano il pigmento del fiore Modulando l’espressione degli enzimi di questo percorso (sovra-espressione/antisenso) è possibile ottenere pigmenti differenti

Modificazione del SAPORE del frutto Utilizzo della Monellina: molecola prodotta dalla pianta africana Dioscoreophyllum cumminsii Monellina: proteina 100.000 piu’ dolce dello zucchero (minore impatto metabolico) Ma….è un dimero formato da 2 catene (A e B) distinte. La separazione frequente delle due catene porta alla perdita della dolcezza in seguito a cottura Quindi….PRODUZIONE DI PIANTE TRANSGENICHE Con gene per la MONELLINA ingegnerizzato: UNICO PEPTIDE

Modificazione delle PROPRIETA’ NUTRITIVE del frutto riso transgenico nel quale viene inserito il gene per la produzione di beta-carotene. (golden rice) Il riso non contiene una vitamina fondamentale per la nutrizione umana: la vitamina A; circa due miliardi di persone nel mondo, soprattutto in alcune zone povere del pianeta, hanno un'alimentazione basata sul riso e soffrono di carenza di questa vitamina Il riso transgenico produce beta-carotene, che viene trasformato dal nostro organismo in vitamina A.

Modificazione delle PROPRIETA’ NUTRITIVE del frutto Vitamina E ( tocoferolo): composto lipofilico ad azione antiossidante..previene l’ossidazione degli acidi grassi e quindi incrementa la stabilità delle membrane cellulari (integrità cellulare). Esistono diversi tipi di Tocoferoli: α β γ δ (dipendono dalla presenza di gruppi metilici sull’anello). L’α-Tocoferolo: maggiore capacità antiossidante. Il γ –Tocoferolo: piu’ abbondante Sovraespressione dell’enzima γ – TMT: maggiore conversione γ-tocoferolo in α-Tocoferolo Amminoacidi Cereali: poca lisina, legumi: poca metionina. Modulando la via biosintetica degli amminoacidi è possibile variarne il contenuto.

Modificazione dei TEMPI di MATURAZIONE del frutto POMODORI TRANSGENICI con MATURAZIONE RITARDATA Sintetizzano l’RNA antisenso dell’enzima POLIGALACTURONASI: controlla la degradazione progressiva dell’acido Poligalacturonico (componenete della parate cellulare del pericarpo della frutta) L’eliminazione dell’enzima rallenta la maturazione del frutto

GENE CITOTOSSICO CHE CAUSA STERILITA’ SE ESPRESSO Modificazione della FERTILITA’’ dei semi Ditte produttrici di SEMI TRANSGENICI (per es.Monsanto) sono interessanti alla produzione di SEMI STERILI per costringere il coltivatore a comprare ogni anno le loro sementi E’ stato introdotto nei semi transgenici il gene RIP: ribosome inactivating protein da Dianthus sinensis GENE CITOTOSSICO CHE CAUSA STERILITA’ SE ESPRESSO

Modificazione della FERTILITA’ dei semi

PIANTE come BIOREATTORI LE PIANTE possono essere utilizzate come BIOREATTORI: “macchine “biologiche capaci di produrre elevate quantità di sostanze. Crescono velocemente e possono generare una BIOMASSA considerevole. La produzione di sostanze puo’ essere indirizzata in specifici compartimenti. Molte sostanze sono prodotte nei SEMI: accumulo e protezione nel tempo Molti anticorpi (plantbodies) sono prodotti in piante: mantenimento di un corretto “ripiegamento”, aggiunta di eventuali modificazioni post-traduzionali (non possibili in E.coli), nessun rischio di contaminazione con patogeni umani. SVANTAGGIO: DIFFICILE LA PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTE SOLUZIONE: PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI CON TAG MOLECOLARI (cromatografia) UTILIZZO: Produzione di 1) proteine farmacologiche, 2) anticorpi, 3) vaccini edibili

PIANTE come BIOREATTORI Vaccini ricombinanti prodotti nelle piante Proteine ricombinanti umane con valore terapeutico prodotte in piante

MELO AGLIO CRISANTEMO VITE LILIUM

MASSIMO 15’ (cronometro) TITOLO, AUTORI, NOME RIVISTA, DATA BREVE INTRODUZIONE SCOPO DEL LAVORO PARTE SPERIMENTALE/RISULTATI DISCUSSIONE MASSIMO 15’ (cronometro)