ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio 1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato respiratorio. Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili

ADENOVIRIDAE più di 100 membri

infezioni lievi ed autolimitanti Adenovirus umani  Sottogruppi Tropismo cellulare Sierotipi A tratto GI 12, 18, 31 B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6 D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30, 32, 33, 36,39, 42,49, 51 E tratto respiratorio 4 F-G tratto GI 40, 41 virus generalmente poco patogeni infezioni lievi ed autolimitanti

STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS 70-100 nm Core : ds DNA - covalentemente legato alla proteina TP - complessato alla proteina VII proteina X (proteasi) proteina V core proteasi Capside (252 capsomeri) 240 esoni : trimeri di proteina II 12 pentoni : Base (pentameri di proteina III) Fibra (trimeri di proteina IV) 70-90 nm proteina IIIA esoni che circondano i pentoni proteina IX esoni delle facce proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il core proteina VIII ancora gli esoni delle facce al core

Il GENOMA degli ADENOVIRUS (ds DNA: 30-36 Kb) ITR SEQUENZE ITR (100bp) regione ORI (replicazione del genoma) regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I sequenza di impacchettamento

Penetrazione di Adenovirus entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente Perdita delle fibre Lisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale : - perdita dei pentoni III e della proteina IIIa - dissociazione della proteina VIII - degradazione proteolitica della proteina VI da parte della proteasi presente nel virione (adenina) - perdita della proteina IX pH

PENETRAZIONE DEL GENOMA liberazione del DNA virale complessato alla proteina VII PENETRAZIONE DEL GENOMA

ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS geni precoci geni tardivi 50 proteine E- geni precoci L- geni tardivi

I GENI PRECOCI ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR

GENE E1A progressione del ciclo cellulare induzione di apoptosi mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari progressione del ciclo cellulare - legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein) induzione di apoptosi - stabilizzazione di p53

nella regolazione della proliferazione cellulare Ruolo di pRb nella regolazione della proliferazione cellulare E1A

E1A p14 E1A

GENE E1A Alterano la progressione del ciclo cellulare: mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R trans-attivatori trascrizionali Alterano la progressione del ciclo cellulare: Stimolano la replicazione del DNA virale Bloccano la risposta ci difesa cellulare: inibizione di STAT1 - inibizione di IKK

Proteine E1B 55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione di p53 19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali. Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.

MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE g E1A a b E1A E1B IB NF-kB E1B p53 CAR integrine E1A pRB geni proliferativi IKK g a b IB NF-kB risposta innata E1A E1B 19kd E1B 55kd p53 geni pro-apoptotici

ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 E2A - ssDBP) E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale replicazione del DNA trascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali

ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione

ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare

Virus-Associated (VA) RNA 1 o 2 trascritti lunghezza: 200 basi codificati dalla Polimerasi III della cellula ospite VAI VA inibizione della dimerizzazione di PKR - mantenimento della sintesi proteica - inibizione delle difese anti-virali

CICLO DI REPLICAZIONE

REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali (aumento dell’efficienza di replicazione) proteina TP legata al terminale 5’ di ogni filamento

REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso - la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP - il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare

Replicazione del DNA l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats” associazione Pol-pre-TP e …… sintesi del filamento complementare From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

I geni intermedi o precoci-ritardati gene IX = proteina IX stabilizzazione del capside virale gene IVa2 = proteina IVa2 transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1A incapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati trimeri di pIX esone

ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L proteine strutturali proteine scaffold proteasi E1A MLTF L1 L2 L3 L4 L5 promotore MLP 52 kd IVa

? TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L trasporto facilitato E4orf6 NES blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma accumulo citoplasmatico di mRNA virali E4orf6 (34KDa) E1B 55KDa NES ? RNA binding fattore cellulare

TRADUZIONE PREFERENZIALE nelle fasi tardive dell’infezione blocco della sintesi proteica della cellula ospite Ad virus (shutoff proteins : L ed E proteins) m7G eIF4F

TRADUZIONE PREFERENZIALE tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) che permette il ribosome shunting L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa L2 - polipeptide III (base dei pentoni) L3 - polipeptide II (esoni) e proteasi L4 - polipeptide 100 kDa L5- polipeptide IV (fibre)

Assemblaggio di adenovirus proteine singole (no poliproteina) ruolo critico della proteina L1 (funzione scaffold ?) citoplasma - formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4. nucleo - formazione dei pentameri di proteina III (pentoni) - formazione dei trimeri di proteina IV (fibre) formazione di capsidi vuoti

RILASCIO DEL VIRUS disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi) E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

Adenovirus terapeutici

espressione della proteina TERAPIA GENICA introduzione del gene esogeno nella cellula “malata” espressione della proteina - correzione del difetto genetico trasformazione di pro-drug - blocco del processo tumorale

Il DNA si degrada velocemente Sistemi di veicolazione del DNA Il DNA si degrada velocemente Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione Meccanismi non virali liposomi polimeri cationici elettropazione micro-iniezione Meccanismi virali buona protezione del DNA bassa efficienza, nessuna specificità assenza di rischio e di reazioni immunitarie ottima protezione del DNA buona efficienza e specificità possibile rischio di infezione reazioni immunitarie

VETTORI PER TERAPIA GENICA ADENOVIRUS infezioni lievi sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità) infezione di cellule in divisione e resting facile manipolazione VETTORI PER TERAPIA GENICA sicurezza alta infettività e selettività espressione sostenuta del gene terapeutico

VETTORI ADENOVIRALI ITR E1A/B L5 E2B E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa (quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb) ITR E1A/B L5 E2B E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 genoma virale Y transgene vettore navetta vettore adenovirale ricombinazione

293 cell La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule della linea cellulare HEK293) lisi 293 cell E1A E1B ITR L5 E2B E3 L1 L2 L3 L4 VA E4 Y transgene nucleo

Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF) VETTORI ADENOVIRALI Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF) - bassa efficienza di transfezione (le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale) bassa efficienza di espressione genica - potente risposta immunitaria un esito mortale (danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale somministrato) Attualmente non sono utilizzati in trials di terapia genica nell’uomo

però……… la sperimentazione continua VETTORI ADENOVIRALI però……… la sperimentazione continua

VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’ loxP Y promoter transgene vettore navetta VA Y ITR E2A/B E4 ITR genoma virale plasmidico L1 L2 L3 L4 L5 ricombinazione in cellule 293 VA Y ITR ITR promoter transgene E2A/B E4 L1 L2 L3 L4 L5 taglio mediato da Cre Y ITR promoter transgene E2B ITR

La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacità avviene in presenza di un costrutto “helper” lisi cellulare ITR E2B Y transgene promoter VA ITR E2A/B E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5

VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’ Limitazioni: contaminazione da helper (in produzioni su larga scala) bassa resa scarsa stabilità Vantaggi: infezioni lievi sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità) infezione di cellule in divisione e resting facile manipolazione alta capacità (35 kbp) espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni)

TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’ Distrofia muscolare (sindrome di Douchen) Fibrosi cistica

* * ADENOVIRUS ONCOLITICI delezione di 827-bp nel gene E1B ADENOVIRUS Onyx - 015 (dl1520) * non esprime E1B 55K * VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 genoma Ad delezione di 827-bp nel gene E1B e parte della regione E3 (gp19K)

replica solo in cellule difettive per p53 ADENOVIRUS dl1520 replica solo in cellule difettive per p53 p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani e nel 70% dei tumori della testa e del collo trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa tumorale)