UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA” EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE TUMORALI DEL COLON Relatore Prof. Luciana Avigliano Candidata Laura Masciullo

CANCRO DEL COLON FATTORI GENETICI FATTORI AMBIENTALI DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIO Elevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIO basso consumo di prodotti di origine vegetale

L’origano è ampiamente utilizzato in tutti i paesi del bacino mediterraneo

MODELLO SPERIMENTALE: SCOPO DELLO STUDIO Effetti chemiopreventivi dell’Origanum vulgare: proliferazione cellulare stato redox apoptosi MODELLO SPERIMENTALE: CELLULE UMANE Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2) Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)

PREPARAZIONE DELL’ESTRATTO DI ORIGANO FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1 CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO D’AZOTO ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO Resa: 20 % (2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)

Caratterizzazione dell’estratto origano Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu): 150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco Capacità Antiossidante Totale: 2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco Composti fenolici flavonoidi acidi fenolici lignani monoterpeni flavoni flavonoli flavanoni antocianine flavanoli isoflavoni stilbeni

ANALISI COMPOSTI FENOLICI (HPLC con rivelatore a fotodiodi  = 310 nm) minuti Acido caffeico Acido rosmarinico Acido ferulico Daidzeina Esperetina

TEMPO DI RITENZIONE (min) (mg/g di estratto secco) Composti fenolici identificati mediante analisi cromatografica (HPLC-DAD) FENOLI CLASSE TEMPO DI RITENZIONE (min) CONCENTRAZIONE (mg/g di estratto secco) % FENOLI Ac. rosmarinico Acidi fenolici 26.7 55.20±6.00 31.80 Naringenina Flavononi 30.0 34.32±1.00 19.82 Esperetina 34.1 2.35±0.11 1.36 Ac. cumarico 21.0 1.40±0.12 0.81 Carvacrolo Terpeni 42.0 1.30±0.09 0.75 Ac. gallico 2.1 0.61±0.06 0.34 Acido caffeico 15.0 0.81±0.08 0.46 Ac.clorogenico 13.1 0.72±0.08 0.41 (+) Catechina Flavanoli 11.2 0.21±0.02 0.11 Diosmetina Flavoni 40.5 0.33±0.03 0.20 Ac.protocatecuico 6.8 0.32±0.02 0.17 Ac. ferulico 24.3 0.15±0.01 0.08 Daidzeina Isoflavoni 31.2 0.07±0.007 0.04 Altri fenoli --- 71.24±10.0 41.18 FENOLI TOTALI 173±12.00 100

L’origano esercita differenti effetti sulle cellule normali e cancerose 20 40 60 80 100 12 24 48 72 % del controllo # * 300 mg/ml 500 mg/ml ore 120 FHC FIBROBLASTI CaCo2 * p<0,05 # p<0,001

L’origano promuove l’arresto della crescita nella fase G2 prevenendo l’entrata in mitosi e inducendo morte cellulare Analisi al citofluorimetro 350 350 Ctrl Ipodiploide 10% G0/G1 49% G2/M 14% S 37% origano Ipodiploide 24% G0/G1 31% G2/M 30% S 39% 280 280 210 210 Eventi Eventi 140 140 70 70 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 FL2-H FL2-H

L’origano induce sia la necrosi sia l’apoptosi Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS Normale Apoptosi Necrosi origano Ctrl 13 % 12 % 18 % 30 %

L’origano attiva le caspasi esecutrici Ctrl origano PARP (89 kDa) caspasi 3 (17 kDa) PARP 2 1 3 Volte su controllo Casp-3 Ctrl origano * * p<0,001 Apoptosis induction was further confirmed by monitoring PARP, a downstream marker of apoptotic death. Oregano extract induced cleavage of full-length PARP (116 kDa) to its 89 kDa fragment: the apoptotic fragment of PARP increased 1.7 fold after treatment with 500 mg/ml oregano for 24 hours (Fig. 4). As in vivo PARP is the target of the effector caspases-3 and 7 (27), we also analyzed expression and cleavage of pro-caspase-3 in Caco2 cells. In agreement with the cleavage of PARP, treatment with oregano led to activation of pro-caspase-3, as indicated by the 2.0 fold increase in the expression of 17 kDa cleavage product, with respect to untreated, control cells (Fig. 4). Activation of the caspase cascade, necessary for cleaving cellular proteins and causing disassembly of the cell, may be achieved through two major apoptotic pathways: the extrinsic (also called the receptor-mediated) and the intrinsic (mitochondria-mediated) pathways, which can function separately, sequentially or in a manner of "crosstalk" (28). To gain insight into the mechanism of action of oregano extract, we analyzed the activation of caspases and regulators, involved either in the death receptor or mitochondrial pathways. Activation of the receptor-proximal caspase 8 is one of the earliest events after receptor aggregation. Treatment of Caco2 cells with Origanum vulgare induced processing of pro-caspase 8: the cleaved, active fragment p18 was significantly increased (4 fold) after 24 h treatment with 500 mg/ml oregano (Fig. 4), thus suggesting an involvement of the death receptor-dependent signalling. Oregano extract also activated the intrinsic apoptotic pathway, as demonstrated by Western blotting performed against several markers. After a 24 hours incubation with oregano, the expression of APAF-1 increased of 1.6 fold, while the expression of pro-caspase-9 decreased of 0.48 fold (Fig. 4). Oregano extract also modulated the expression of pro- or anti-apoptotic members of the Bcl-2 family; in particular, it increased the protein levels of pro-apoptotic Bak, while down-regulating the expression of anti-apoptotic Bcl-xL (Fig. 4).

L’origano attiva la via intrinseca e la via estrinseca dell’apoptosi caspasi 8 (18 kDa) Via recettoriale APAF-1 (130 kDa) pro-caspasi 9 (47 kDa) Via mitocondriale Bak (25 kDa) pro-apoptotico Bcl-xL (30 kDa) anti-apoptotico tubulina * p<0,05 # p<0,001 5 # Ctrl 3 # origano 4 2.5 Volte su controllo 3 2 * 1.5 2 1 * 1 # 0.5 Casp-8 APAF-1 Pro casp-9 Bak Bcl-xL

Fluorescenza (unità arbitrarie) L’origano promuove una perturbazione nel potenziale di membrana mitocondriale Colorazione con JC-1 ed analisi al FACS origano Ctrl Ctrl origano Fluorescenza (unità arbitrarie) Furthermore, oregano extract promoted a perturbation in the mitochondrial membrane potential, as measured by uptake of the fluorescent dye JC-1 (Fig. 5), thus corroborating its influence on the death mitochondrial pathway. So, triggering a collapse in membrane potential, oregano might promote opening of the mitochondrial permeability transition pores and release of cytochrome c. Once released, cytochrome c will bind the cytosolic protein Apaf-1 and ATP, thus forming a ternary structure named apoptosome, able to recruit and activate pro-caspase-9, which in turn will activate other caspases and trigger the cascade of events leading to apoptosis.

L’origano riduce il glutatione totale ed incrementa il GSSG Capacità antiossidante totale Livelli di ROS Ctrl 32% Origano 36% nmoli Trolox eq./mg proteina Ctrl origano Glutatione totale Glutatione ossidato (nmoli/mg proteina) Glutatione totale GSSG/GSH x 100 Ctrl origano Ctrl origano

Arresto della crescita e morte cellulare L’estratto di origano promuove: Alterazione dello stato redox Attivazione delle vie apoptotiche Arresto della crescita e morte cellulare

CONCLUSIONI Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente, ma all’alimento “in toto” I colonociti sono le cellule che “in vivo” entrano a diretto contatto con la spezia 100 mg Gli effetti anti-tumorali si ottengono con quantità di origano raggiungibili con la dieta Mediterranea La diffusione dell’origano potrebbe essere correlata a questi effetti benefici

Gli effetti protettivi dipendono dall’estratto “in toto” e non dai singoli componenti volte su controllo 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 CTRL A. ROSMARINICO A. CAFFEICO A. CLOROGENICO A. COUMARICO A.GALLICO CARVACROLO (+) CATECHINA A. PROTOCATECUICO DAIDZEINA A. FERULICO ESPERETINA NARINGENINA DIOSMETINA volte su controllo 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 CTRL ORI 500 MIX 13 * * * p<0,001