Tecniche ottiche innovative: applicazioni in medicina

Microscopia ottica di (auto)fluorescenza Microscopia confocale Optical tweezers (pinzette ottiche)

campione

Microscopia di (auto)fluorescenza cos’è l’autofluorescenza microscopia ad autofluorescenza sorgente di eccitazione il campione ottiche di raccolta immagini in autofluorescenza spettro di autofluorescenza vantaggi e svantaggi della tecnica

cos’è l’autofluorescenza Le cellule ed i tessuti biologici contengono molecole che, se eccitate con radiazione di opportuna lunghezza d’onda, sono fluorogeniche L’autofluorescenza è l’emissione di fluorescenza spontanea, dovuta a fluorofori endogeni in cellule e tessuti. L’ autofluorescenza è così denominata per essere distinta dalla fluorescenza ottenibile con marcatori fluorescenti esogeni (fluorescenza indotta o secondaria).

tra i principali fluorofori responsabili dell’autofluorescenza vi sono: biomolecole coinvolte in processi metabolici e funzionali (es.: coenzimi nicotinici, flavine, lipofuscine) biomolecole con funzione strutturale (es.: collageno, elastina)

corrispondente immagine h immagine di cellula in trasmissione (100x, NA=1.3) corrispondente immagine in autofluorescenza

(auto)fluorescenza: spettri di assorbimento e di emissione

La tecnica sorgente per l’eccitazione ottiche di focalizzazione cella con il campione ottiche di raccolta rivelatore analisi dei dati (Nikon Italia)

Schema di principio (misura in trasmissione) rivelatore II filtro Filtro di raccolta: seleziona la banda di emissione e blocca la luce di eccitazione non assorbita dal campione campione Filtro di eccitazione: seleziona la banda di eccitazione I filtro sorgente (misura in trasmissione)

Problemi della tecnica in trasmissione: assorbimento della luce di eccitazione da parte del campione assorbimento dell’emissione da parte del campione diffusione della luce di eccitazione e di emissione da parte del campione non si ottimizza la raccolta dell’emissione, a meno di non avere un condensatore di qualità pari all’obiettivo scarsa praticità (non adatta a microscopi invertiti)

tecnica in riflessione rivelatore sorgente campione tecnica in riflessione filtro per l’emissione specchio dicroico filtro per l’eccitazione obiettivo l’emissione non attraversa il campione l’obiettivo agisce sia da ottica di focalizzazione che di raccolta maggior praticità (microscopi invertiti)

al rivelatore dalla sorgente per l’eccitaz. exc FLUOR

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curve di trasmittanza per differenti dicroici T: luce trasmessa (%) 211

sorgente per l’eccitazione deve avere una buona emissione nella zona UV-blu dello spettro (300400nm) deve avere un’alta brillanza, costante nel tempo in genere si utilizza una lampada ad arco corto a vapori di mercurio in alternativa: lampada a vapori di Xenon; Xe-Hg; luce laser*

vapori di Hg ad alta pressione vita media: 100-300 ore 50-300 W (Osram) alloggiamento (Nikon) per la lampada a vapori di mercurio regione di emissione (arco) bulbo di quarzo vapori di Hg ad alta pressione vita media: 100-300 ore 50-300 W 1000-3000 lumen 30000-170000 Cd/cm2 spettro a righe su un fondo continuo spettro di emissione

altre sorgenti lampada a Xenon ad arco corto, con vapori di Xenon spettro continuo, poco intenso nell’UV-A più adatta per eccitazione nel visibile (blu) alta brillanza lampada a Xe-Hg Allo spettro dello Xenon somma quello del mercurio. lampade alogene Scarsa emissione nelle bande UV. Brillanza inferiore alle lampade ad arco corto. 204

il campione cellule in condizioni vitali fettine sottili di tessuto (cellule fissate) ATTENZIONE A: presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura => lavare le cellule ! cellule morte: rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo => aumenta il fondo ! usare vetrini (ed ottiche) non fluorescenti

c1,c2: cellule adese sul fondo ob. porta oggetti copri oggetti c1 c2 c1,c2: cellule adese sul fondo spessore della cella di misura: paragonabile alle dimensioni di una cellula segnale: può provenire in parte dal tampone

emissione di autofluorescenza spettro della luce emessa immagine della luce emessa INFO: metaboliche funzionali INFO: strutturali morfologiche

MIAM (Multispectral Intensity Autofluorescence Microscopy) acquisizione sia dello spettro che dell’immagine di autofluorescenza MIAM (Multispectral Intensity Autofluorescence Microscopy) spettrometro CCD per imaging di autofluorescenza avrò bisogno di:

un possibile setup sperimentale SPECTRUM ANALYSER COOLED CCD CAMERA

immagini come si acquisiscono cenni ai sensori CCD come accoppiare obiettivo e telecamera risoluzione spaziale

Charge Coupled Device (CCD) CCD: array di elementi fotosensibili , lineari o bidimensionali (es.: 512x512; 1024x1024, dimensione elemento tipica 10 m x 10 m) I fotoni incidenti sulle zone sensibili generano elettroni (fotoelettroni) che vengono accumulati in regioni dette pixel I fotoelettroni vengono intrappolati nei pixels da un campo elettrico locale La presenza di elettrodi permette di spostare i fotoelettroni sul CCD l’intensità del pixel è proporzionale al numero di fotoelettroni prodotti, ovvero all’energia rilasciata dalla luce incidente

in alternativa: immagine a colori Immagine in bianco e nero. CCD B/N Immagine in bianco e nero. Il livello di grigio di ogni punto è proporzionale all’intensità luminosa che arriva. emissione di autofluorescenza in alternativa: CCD colori immagine a colori Soluzione meno adatta. Spesso non ha la sensibilità e risoluzione spaziale di una CCD B/N.

+ + = F1 CCD F2 CCD F3 CCD revolver con i 3 filtri filtro passa banda emissione di autofluorescenza revolver con i 3 filtri F1 CCD Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce ROSSA incidente + F2 CCD Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce VERDE incidente + F3 CCD Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce BLU incidente immagine RGB finale (ad ogni immagine sostituisco i livelli di grigio con livelli di Rosso, Verde, Blu rispett.) = filtro passa banda

BLU VERDE ROSSO 3 acquisizioni distinte, in successione temporale immagine finale ricombinazione di immagine (es.: 3 layer con Photoshop® ) problemi derivanti dal movimento del campione e dal bleaching

CCD ruota porta-filtri filtri a banda larga centrati su: R: ~650nm G: ~550nm B: ~450nm

come accoppiare la CCD all’obiettivo

Il flusso di eccitazione focalizzato sul campione è proporzionale a (NAobj)2

(epi- : “raccolgo dalla stessa parte da cui eccito”) EPI-FLUORESCENZA (epi- : “raccolgo dalla stessa parte da cui eccito”) L’intensità di fluorescenza emessa è proporzionale al flusso di eccitazione (se questo non è così elevato da produrre quenching)

La frazione di autofluorescenza emessa che viene recuperata dall’obiettivo è proporzionale a (NAobj)2

L’intensità che arriva su ogni pixel (I) Se l’ingrandimento totale sul rivelatore (fotocamera) è M, verrà proiettata un’immagine di una superficie M2 volte più grande, Ovvero L’intensità che arriva su ogni pixel (I) è proporzionale a 1/ M2 RIASSUMENDO I  (NAobj)4 / M2

E’ la minima interdistanza r tra 2 punti sorgente visti come distinti: RISOLUZIONE SPAZIALE Criterio di Raileigh E’ la minima interdistanza r tra 2 punti sorgente visti come distinti: r(m) = 0.61  / NAobj r “piccolo” => grande risoluzione La risoluzione cresce proporzionalmente a NA = 550nm, NA =1.4 r = 0.24 m

Per ottimizzare la risoluzione del sistema microscopio-CCD r M La larghezza W del pixel deve essere tale che W  (rM)/2 = 0.61  M / 2NAobj Ovvero M  2W/r = 2 W NAobj / (0.61) W r M

(Tra 75x e 113x la risoluzione non cambia….) ESEMPIO Pixel 9x9 m ; = 550nm; NA =1.4 M  2W/r = 2 W NAobj / (0.61) M  18/r = 18/0.24 = 75 x Volendo incrementare la risoluzione dobbiamo far sì che la distanza tra 2 punti sia almeno di 3 pixel e quindi aumentare M M  3W/r =27/0.24 =113x (Tra 75x e 113x la risoluzione non cambia….) M non dipende solo dall’obiettivo. Per es. nei microscopi Nikon c’è un’ulteriore ingrandimento 2x o 1.5x sulla porta della fotocamera

Ricordando che I  (NAobj)4 / M2 è necessario un compromesso tra intensità del segnale e risoluzione (ingrandimento) Fissata NAobj, I alta => M “basso” => fissata la dimensione dei pixel, con M basso posso non arrivare a sfruttare la risoluzione dell’obiettivo M “alto” => I bassa: fissata NAobj, con M alto posso avere un’intensità troppo bassa => basso rapporto segnale-rumore

risoluzione spaziale del sistema CCD - obiettivo Ci si dovrebbe sempre riferire alla risoluzione spaziale dell’intero sistema CCD - obiettivo Viene a volte definita per la sola CCD, come numero di pixel totali o come dimensioni dell’elemento sensibile: non e’ una vera risoluzione! dipende dalla risoluzione spaziale dell’obiettivo e dalle caratteristiche della camera la camera deve essere commisurata all’obiettivo in uso: e’ inutile usare una camera da 5Mpixel con un obiettivo a bassa apertura numerica (es.: N.A.=0.4). Otterro’ la stessa risoluzione spaziale complessiva usando per es. una camera da 2Mpixel!

Risposta spettrale Indica la sensibilita’ alla luce di una data . Il dato viene presentato come efficienza quantica (Quantum Efficiency) o come risposta (Responsivity o Sensitivity) in funzione di . Serve a scegliere la camera capace di rispondere alla banda spettrale della radiazione considerata. Tutti i CCD al silicio hanno una risposta soddisfacente nel visibile e fino a 1000nm circa.

sensore 512x512 pixel o superiore con pochi difetti costruttivi Esempio sensore 512x512 pixel o superiore con pochi difetti costruttivi dimensione del pixel: 5-10 mm raffreddata (fino a -30 oC) tempo di integrazione di immagine: da 1ms a >30s; tempi tipici: 1-4s tempo di svuotamento del sensore (lettura immagine): 2-4s In pratica: se non si vogliono vedere fenomeni veloci (t<<1s) è indicata una CCD più sensibile ma più lenta.

Efficienza di raccolta max 10% Gli elementi ottici del microscopio (flitri dicroici, lenti, filtri interferenziali etc. ) riducono la luce Efficienza di raccolta max 10% Efficienza media delle camere CCD (front illuminated ) circa 40% nel blu circa 20 % (back illuminated) circa 70% nel blu circa 40 % EFFICIENZA TOTALE 4%

Rumore nelle CCD Rumore: lo scarto quadratico medio della variazione del segnale catturato da un pixel Rumore quantistico: Photon noise (shot noise). Dovuto alla variazione statistica del numero di fotoni incidenti e portatori di carica prodotti (N). SNR = N/√N = √N migliora al crescere di N. Es.: 0.1105 fotoni/(spixel) Rumore termico: dark noise (dark current). Dovuto alla generazione di portatori di carica termici. Cresce con la temperatura T. Es.: 0.01 50 elettroni/(spixel) Rumore elettronico: read noise. E’ relativo ai processi di conversione della carica prodotta in segnale digitale. Non dipende dal tempo di esposizione. Dipende poco da T; piu’ importante a bassi livelli di segnale. Es.: 0.1  20 elettroni rms/pixel

Rumore totale sul segnale: Segnale massimo (saturazione) Dinamica = Dinamica usualmente espressa in bit di risoluzione: es. dinamica di 16 bit

binning E’ l’accorpamento di piu’ pixel in un unico pixel risultante. Es.: 600x1000 pixels =>200x125 pixels con binning 3x8  accresce il rapporto S/N, la sensibilita’, la velocita’ di acquisizione diminuisce la risoluzione spaziale; accresce la corrente di buio Usato spesso in modalita’ di preview, o per avere immagini sufficientemente intense con alto frame rate (« il segnale che perdo andando veloce, lo recupero con il binning, perdendo pero’ in risoluzione spaziale ») ☺

per diminuire il rumore Rumore quantistico: si accresce il numerodi fotoelettroni prodotti (se si puo’…)  (i) eccitazione piu’ intensa (ii) tempi di integrazione maggiori (iii) binning (iv) CCD con efficienza quantica piu’ alta Dark noise: si raffredda il sensore CCD (tipicamente T=-5-20 oC, fino a T di N2 liquido) Read noise: filtri elettronici. Sensore con elettronica migliore.

rapporto segnale-rumore: ~ 2 segnale: media dei valori dei pixel della cellula rumore: media dei valori dei pixel del fondo Aumentare il tempo di integrazione. Aumentare l’intensità di eccitazione. (pero’: rischio di bleaching e danno cellulare !) Raffreddare maggiormente la CCD Verificare la corretta centratura dell’illuminazione UV Lavare ulteriormente le cellule (con tampone non fluorescente)

spettro di autofluorescenza cos’è come si acquisisce un esempio

immagine di un fascio con spettro fatto di righe l’emissione di autofluorescenza raccolta dall’obiettivo viene inviata ad uno spettrometro (es. attraverso una fibra ottica) lo spettrometro la separa nei vari colori; il fascio così suddiviso incide su una telecamera CCD, di larghezza pari alle dimensioni trasversali del fascio. l’intensità luminosa, per ogni lunghezza d’onda, viene così trasformata in segnale (livello di grigio del pixel corrispondente) immagine di un fascio con spettro fatto di righe (illuminazione “al neon” del laboratorio)

CCD per l’acquisizione dello spettro policromatore (spettrometro) raccordo fibra-microscopio alloggiamento per la fibra ottica mazzo di fibre (bandolo) CCD per l’acquisizione dello spettro policromatore (spettrometro) arrivo della fibra e fenditura di ingresso al policromatore

spettro = istogramma dei conteggi della CCD dimensione trasversale del fascio sulla CCD (=dimensione maggiore della fenditura) dimensione maggiore della CCD: asse della lunghezza d’onda numero di conteggi spettro = istogramma dei conteggi della CCD N.conteggi()  intensità luminosa ()

spettro corretto spettro “grezzo”

vantaggi su altre tecniche non richiede particolare preparazione del campione scarsamente invasiva (assenza di fluorofori esogeni) campioni in condizioni vitali intensità di eccitazione contenuta MIAM: info sia morfologiche che funzionali

svantaggi il segnale è basso => CCD sensibili, a basso rumore uso di ottiche con bassissima emissione di fluorescenza non tutti i compartimenti cellulari sono autofluorescenti (es. nucleo) minor selettività rispetto alla fluorescenza per lo studio di specifiche strutture cellulari la massima utilità e’ su campioni vivi (ex-vivo)

conclusioni emissione di autofluorescenza misura del segnale di autofluorescenza: - sorgente di eccitazione - campione ed emissione - raccolta di luce analisi dell’emissione: - immagini - spettro

microscopia confocale Microscopio confocale · luce laser incide su un punto del campione alla volta · la luce che proviene dai punti non a fuoco viene bloccata dal diaframma B · per vedere un punto del campione, bisogna che siano a fuoco contemporaneamente la luce incidente sul punto e quella riflessa, che deve poter passare per il foro del diaframma B; in questo modo i punti non a fuoco non danno effetti indesiderati di luminosità ambientale · la tecnica richiede la scansione punto per punto della zona di interesse del campione credit: UniTOrino, Dip. Biologia Vegetale

MICROSCOPIA CONFOCALE

…cominciamo con un confronto: 1) microscopia ottica convenzionale non solo il piano di fuoco dell'obbiettivo, ma anche gran parte dello spessore dell'oggetto biologico sono uniformemente e simultaneamente illuminati => le aree sopra e sotto il piano focale di interesse rendono meno distinguibili le strutture cellulari.

campione

2) microscopia confocale la luce emessa da regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo viene eliminata l'illuminazione non e' simultanea, ma sequenziale, concentrata come un punto su un singolo elemento del volume del campione alla volta - per formare l'immagine, il raggio luminoso di illuminazione esplora il campione secondo uno schema raster sorgente laser: monocromatica, molto sottile e poco penetrante la luce riflessa o la fluorescenza emessa vengono rilevate da un tubo fotomoltiplicatore e convertite in segnale digitale (=> monitor) principio di Minsky: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo elemento del volume dell'oggetto biologico, ovvero sono confocali un filtro spaziale (pinhole), messo davanti al rivelatore, elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo => immagine piu’ dettagliata, perche' vengono eliminate le informazioni fuori fuoco.

Credit: Luca Verderame (liceo ISSEL, Finale Ligure) Giacomo Carrabino (liceo A. Pacinotti, La Spezia) Gabriele Marino (liceo Grassi, Savona)

Microscopia ottica “convenzionale” Microscopia confocale in riflessione in trasmissione

vantaggi svantaggi Maggiore risoluzione spaziale Maggior contrasto miglior sezionamento ottico => migliore qualità ricostruzioni 3D campioni “sezionabili” in vari piani spaziali, non solo x-y disponibilità di ottime soluzioni commerciali ma anche “fai da te” svantaggi peggiore risoluzione temporale* maggiore invasività (in alcuni casi) maggior costo * vedi pero’ sistemi a molti punti

pinzette ottiche (optical tweezers)

“Tecnica che utilizza luce fortemente focalizzata per esercitare forze di intrappolamento stabile su oggetti microscopici, in genere presenti all’interno di una soluzione acquosa” “in sostanza, l’oggetto è intrappolato perché si crea, in 3D, una buca di potenziale stabile, le cui caratteristiche dipendono dalla sorgente, dalla focalizzazione, dalle caratteristiche fisiche del mezzo e dell’oggetto” luce laser ( t.c. bassissimo assorbimento da parte del mezzo e dell’oggetto) obiettivi ad alta apertura numerica campione tale che nmezzo<noggetto intrappolato “oggetto”: 10nm-10µm (es.: batterio, cellula eucariota, sferetta di lattice)

“perché funziona” Schema di principio regime di ottica geometrica regime di ottica fisica Intrappolamento di una sfera dielettrica: regime di ottica geometrica. Cessione di momento dall’onda all’oggetto.

regime di ottica fisica Intrappolamento verticale si distinguono 2 tipi di forze: Fg=forza di gradiente Fs=forza di scattering Intrappolamento: piano orizzontale. W0: semi-larghezza del fascio laser

La forza del tweezer aumenta proporzionalmente alla potenza del fascio laser per ottenere trappole forti è necessario usare fasci con grandi angoli di convergenza  (fino a 70gradi), altrimenti assialmente la forza di scattering domina su quella di gradiente per ottenere grandi angoli di convergenza è necessario usare un obbiettivo ad alta apertura numerica (fino a 1.4) e presentare in ingresso a questo un fascio di dimensioni maggiori o uguali al suo diaframma di ingresso il tweezer è più forte radialmente che assialmente la stabilità del tweezer può essere quantificata dal rapporto tra la profondità U della buca e kBT. Si può definire stabile una trappola in cui è maggiore di un valore di soglia (per es. 50 o 100) oltre il quale gli effetti di moto termico possono essere considerati trascurabili e la particella pensata come “ferma” se l’indice di rifrazione della particella è inferiore a quello del mezzo in cui è immersa (es. una bolla d’aria in acqua), il tweezer non è stabile poiché la forza di gradiente cambia verso. L’effetto è repulsivo.

Esempio di setup per una pinzetta ottica accoppiata ad un microscopio

pinzette multiple è possibile commutare la posizione di focalizzazione del laser fra 2 o piu’ punti del campione dovro’ usare per es. un Modulatore Acusto-Ottico frequenza di commutazione: es: 1KHz (mi devo confrontare con il moto diffusivo dell’oggetto) ultima frontiera: pinzette multiple (N>1000) sfruttando effetti diffrattivi di speciali “chip”

applicazioni “chromosome surgery” / genetica studi su mitosi e motilità cellulare studi sulla membrana cellulare / fusione cellulare fertilizzazione in vitro “scalpello laser” principi del funzionamento muscolare protein folding biofisica di singola molecola / cellulare

CONTRO PRO applicabile ex vivo, in vitro permette di manipolare la singola cellula / batterio / molecola utilizzabile insieme a numerose altre tecniche di microscopia campione immerso in un mezzo liquido (es.: soluzione tampone) scarsa preparazione del campione possibilità di misure di forza / lunghezza (=> parametri elastici) di tipo “puntuale” bassi costi (se “basta che funzioni”) non applicabile in vivo non applicabile “a secco” difficilmente applicabile ad un sistema con N »1 elementi (pur se microscopico) difficilmente applicabile ad oggetti di dimensioni » 10-50 µm alti costi (se si vogliono grandi forze, basso rumore, alta risoluzione spazio-temporale) ancora non (sufficientemente) disponibile come “kit all included” in commercio non facilmente trasportabile da un luogo all’altro