Il ruolo dei microrganismi nella digestione anaerobica workshop ERSAF, 28 maggio, 2008 Il ruolo dei microrganismi nella digestione anaerobica Prof. Daniele Daffonchio Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM), Università di Milano

IL METABOLISMO MICROBICO Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo. I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro catabolismo e delle esigenze nutrizionali. Fonte di energia Donatore di H Accettore di e- Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati Radiazione Fototrofi Ossidazione Chemotrofi Prod. inorg. ridotti NH4+; NO2-; S2-; S; S2O32- Molec. org. ridotte Zuccheri; lipidi; proteine O2; Aerobi Mol.org.ox; NO3-; SO42-; CO2 Anaerobi

IL METABOLISMO CATABOLICO Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi: STADIO 1 Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli. Non viene rilasciata energia. STADIO 2 Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte dell’energia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH+) e importanti intermedi metabolici (es. piruvato): STADIO 3 Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni.

IL CATABOLISMO OSSIDATIVO Se si sottraggono intermedi dal ciclo (ad es. per le biosintesi metaboliche, o per la produzione industriale) reazioni anaplerotiche (di riempimento) intervengono per ripristinare l’equilibrio ricostituendo i precursori del ciclo Reazioni anaplerotiche

IL CATABOLISMO FERMENTATIVO Glucosio

IL METABOLISMO ANABOLICO dalle vie degradative principali si originano tutti i pathways anabolici: per aminoacidi alifatici e aromatici, lipidi, nucleotidi purinici e pirimidinici, ecc.

LA METANOGENESI POLIMERI MONOMERI ALCOLI SUCCINATO LATTATO 1 Acidogenesi MONOMERI 1 1. Batteri fermentanti acidogeni primari 2. Batteri fermentanti secondari (sintrofici) 3. Batteri omoacetogeni 4. Metanogeni idrogenotrofi 5. Metanogeni acetoclasti ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 Acetogenesi 2 COMP. C1 H2 ACETATO 3 Metanazione 4 5 CH4 CO2

GLI ARCHAEA METANOGENI LE REAZIONI DI METANAZIONE ORDINE: METHANOBACTERIALES Famiglia: Methanobacteriaceae Genere:Methanobacterium Genere: Methanobrevibacter H2/CO2 Genere: Methanosphaera formiato Famiglia: Methanothermaceae Genere: Methanothermus ORDINE: METHANOCOCCALES Famiglia: Methanococcaceae Genere: Methanococcus H2/CO2 ORDINE: METHANOMICROBIALES Famiglia: Methanomicrobiaceae Genere: Methanomicrobium Genere: Methanogenium H2/CO2 Genere: Methanoculleus Genere: Methanospirillum Famiglia: Methanocorpusculaceae Genere: Methanocorpusculum H2/CO2 Famiglia: Methanoplanaceae Genere: Methanoplanus H2/CO2 Famiglia: Methanosarcinaceae Genere: Methanosarcina acetato H2/CO2 Genere: Methanococcoides Genere: Methanolobus methanolo Genere: Methanohalophilus Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato LE REAZIONI DI METANAZIONE 4H2 + HCO3- + H+ CH4 + 3H2O 4HCOO- + H+ + H2O CH4 + 3 HCO3- CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- ACETATO: AFFINITA’ E Vmax Ks Vmax (mM) (h-1) Methanosarcina 0.7 0.032 Methanosaeta 5 0.002-0.003

GENOMI SEQUENZIATI

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile dalla degradazione aerobica C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O (DG°’ = -2870 kJ/mole) C6H12O6 3CO2 + 3CH4 (DG°’ = -390 kJ/mole) La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di “SINTROFIA” la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la co-coltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a: Strain S 2CH3CH2OH + 2H2O 2CH3COO- + 2H+ + 4H2 (DG°’ = +19 kJ per 2 mol of ethanol) Strain M.o.H. 4H2 + CO2 CH4 + 2H2O (DG°’ = -131 kJ per mol of methane) Co-Culture 2CH3CH2OH + CO2 2CH3COO- + 2H+ + CH4 (DG°’ = -112 kJ per mol of methane)

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H2, HCOO- E CH3COO- in cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la produzione da parte degli acetogeni sintrofici

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA

METANOGENESI: PATHWAYS ALTERNATIVI Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi, metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato, H2 e CO2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo. In presenza di efficienti “scavenger” per l’H2 come i metanogeni la maggior parte del flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H2 e CO2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintrofici hanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due livelli trofici. MONOMERI (glucosio) 1 Acetogenesi Metanazione COMP. C1 H2 ACETATO 2 3 CH4 CO2 1 Spirochete; 2 Metanogeni H-trofi; 3 Metanogeni acetoclasti

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE Quale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress? La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione del substrato a CH4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali. FLUSSI METABOLICI PARALLELI Nel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione (acetato ed H2) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle spirochete a quella con l’intervento di acetogeni sintrofici FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI Nel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H2 avviene attraverso step metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici.

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE Per verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni) . FLUSSI METABOLICI PARALLELI FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE L’analisi d’immagine computerizzata dei morfotipi microbici e l’analisi ARDRA dei cloni in librerie di 16S ottenute dai due set di reattori indicavano una distinta composi-zione in m.o.: REATTORI HS (high-spirochete) dominati da spirocheTe, bastoncini corti e Methanosarcina. REATTORI LS (low spirochete) dominati da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla composizione iniziale dopo 24 giorni dall’inizio della perturbazione. Mentre le popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE Dal punto di vista metabolico, la co-munità LS reagiva più prontamente: ripristinando in un tempo più breve gli equilibri iniziali di concentrazione dei metaboliti del processo di metanogenesi. Le caratteristiche del processo HS erano: i) Più lenta utilizzazione del substrato glucosio. ii) Mantenimento di un livello più basso dei metaboliti intermedi. iii) Inizio simultaneo dei diversi processi fermentativi (produzione dei diversi acidi).

METANOGENESI: DIVERSITA’ MICROBICA E STABILITA’ FUNZIONALE Comunità microbiche con i principali flussi metabolici paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico rispetto a comunità con flussi metabolici seriali. Comunità microbiche più complesse (con maggiore biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate in maniera funzionalmente diversa. Per un’efficiente risposta agli stress alla biodiversità genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità funzionale.

METANOGENESI: I REATTORI Per la digestione anaerobica dei reflui si distinguono diversi tipi di reattori che si differenziano per: Schema idraulico dei sistemi Forma della biomassa (libera, adesa)

METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI Reattori a biomassa libera Reattori a biomassa adesa Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia (es. la rimozione dell’H2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H2 tossico per gli acetogeni) Stabilità della biomassa nel reattore (basso “washout” cellulare) Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed) La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam. 0.1-1 cm) ad alta sedimentabilità Reattori a letto fisso espanso fluidizzato Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte (plastica, legno,ecc.) Strati di microrganismi Materiale di supporto

METANOGENESI: I REATTORI UASB Biogas Effluente Ricircolo Influente MESOFILI TERMOFILI

METANOGENESI: I REATTORI UASB Nei reattori UASB (Upflow anaerobic sludge Blanket) si sviluppano granuli con biomassa strati-ficata in cui sono particolarmente effi-cienti gli scambi tro-fici tra i diversi m.o. (es. metanogeni e acetogeni sintrofici). L’ibridazione in situ con sonde specifiche per Archaea (rosse) e per Bacteria (verdi) mostra che gli strati superficiali sono prevalentemente colonizzati da batteri, mentre gli strati profondi dei granuli sono colonizzati da archaea, sia in granuli mesofili che termofili. La parte centrale dei granuli non da segnale di ibridazione e sembra costituita da residui cellulari e materiale inorganico.

METANOGENESI: I REATTORI UASB M.saeta (rosso) Eubacteria (verde) M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.microbiaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.sarcinaceae (rosso) Eubacteria (verde) MESOFILI TERMOFILI METANOGENESI: I REATTORI UASB

METANOGENESI: I REATTORI UASB ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) ARC915 SYN-7 ARC915+SYN-7 ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina) EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina) MX825: sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina) MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) METANOGENESI: I REATTORI UASB ARC915+EU338+MX825 MG1200+SYN-7

Sekiguki et al. 2001 Appl. Environ. Microbiol., 67:5740-5749

INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASB L’interazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H2) ed indiretti (es. lattato, etanolo, ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH4 e H2S, per misurare negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la concentrazione dei 2 gas e l’attività metanogenica e sulfidogenica. Granuli metanogenici-sulfidogenici Granuli metanogenici Le analisi di attività e di microprofili dei gas indicano che i solfatoriduttori si posizionano negli strati più esterni del biofilm, mentre gli archaea metanogeni colonizzano il centro del granulo. Questi risultati venivano confermati da esperimenti di ibridazione “in situ”.

STABILITA’ DELLA BIOMASSA FAVORIRE: Bassa idrofobicità superficiale biofilm Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del biofilm Biogas Effluente Washout Washout 1 cm Influente

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i DG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: Ad alti carichi organici ed alte produzioni di biogas la biomassa granulare inizia a flottare ed è trasportata fuori dal reattore con il fenomeno del wash-out della biomassa

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI, mentre la maggior parte dei metanogeni e degli acetogeni sono IDROFOBICI

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i DG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: C’è quindi una finestra ottimale di tensione superficiale del liquido che aumenta l’esposizione di batteri idrofilici sulla superficie dei granuli e abbassa i valori di DG di adesione per i microganismi idrofilici

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata: La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico che deve essere stabilito tra l’esterno e l’interno del granulo. All’esterno del granulo è abbondante il glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che sono idrofilici

LA METANOGENESI POLIMERI MONOMERI ALCOLI SUCCINATO LATTATO Produzione di idrogeno scorporando le fasi di acidogenesi da quella di metanazione per favorire la produzione fermentativa di idrogeno 1 Acidogenesi MONOMERI 1 ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 Acetogenesi 2 COMP. C1 H2 ACETATO 3 Metanazione 4 5 CH4 CO2

PRODUZIONE DI IDROGENO

PRODUZIONE DI IDROGENO Produzione di idrogeno da reflui solidi scorporando acidogenesi da metanazione in due reattori con diverso tempo di ritenzione

PRODUZIONE DI IDROGENO Aumento dell’accumulo di idrogeno attraverso “sparging” di gas nel reattore Aumento delle rese di metano nel rattore metanogenico

Grazie per l’attenzione !