Escherichia coli Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Presenza di plasmidi stabili Presenza di plasmidi stabili 3 m

Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA (DIMENSIONI ca kBp) DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni biotecnologiche: copie/cellula) GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI) bla= resist. ampicillina ColE1= origine di replicazione

La regione di importanza clou del vettore despressione: il Multiple Cloning Site (MCS) Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore despressione a valle di un promotore specifico. A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)

Luso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA ricombinante Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento. Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5 o 3) o taglio blunt end.

Luso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse

Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

Cosa occorre per lespressione ad alto livello di una proteina nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilità Trascrizione/traduzione/stabilità Promotore forte (trascrizione) Presenza di segnali per il riconoscimento dellmRNA da parte dei ribosomi (traduzione) Assenza di proteasi specifiche (stabilità)

Il Promotore perfetto (?) A AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn Riconosciuto dalla subunità Riconosciuti dalla subunità 4-6nt 14nt 17nt 4-6nt +1-10Ext.-35UP element +1 A An....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term. (Ribosome Binding Site/ SD box (Shine-Dalgarno) Terminatore di trascrizione 5-7 nt

Produzione di proteine eterologhe Domanda: Domanda: Un sistema spinto al massimo, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine eterologhe? Risposta: NO Problemi di tossicità di proteine eterologhe, e della loro conformazione corretta

Tossicità di proteine eterologhe nellospite Escherichia coli Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Interazione erronea con componenti cellulari: Interazione erronea con componenti cellulari: Legame al DNA Danno al DNA Stress ossidativo Interazione/sequestro di altre proteine essenziali Induzione di sistemi di risposta allo stress

Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Produzione di proteina (unità arbitrarie)

Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

Plac, il promotore inducibile per eccellenza AB (LacI) (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG)

P lac LacI IPTG P tac Derivati di P lac * più forti P trc *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi

Phage T7

Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dellRNA polimerasi batterica)

Ara C -Ara represses P BAD +Ara induces P BAD RNA pol P BAD AraC P BAD

EK=Sito di proteasi Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici

Luso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Ma troviamo sempre siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?

Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain reaction) Ibridazione con sonde specifiche per lamplificazione del gene bersaglio DNA-sintesi (15-20 nt)

Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT (BamHI) (HindIII) AAGCTT GGATCC

Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT (BamHI) (HindIII) GGATCC AAGCTT

Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

Fattori post-trascrizionali che possono influenzare lespressione Fattori post-trascrizionali che possono influenzare lespressione Stabilità del mRNA: lutilizzo di alcuni mutanti in alcune RNasi (ad es. le esonucleasi RNasi II, PNPasi o la endonucleasi RNasiE) può far aumentare la stabilità dei trascritti Stabilità del mRNA: lutilizzo di alcuni mutanti in alcune RNasi (ad es. le esonucleasi RNasi II, PNPasi o la endonucleasi RNasiE) può far aumentare la stabilità dei trascritti Differenze nelluso dei codoni tra procarioti ed eucarioti può avere un impatto sulla produzione di proteine eterologhe in E. coli (ad es. i codoni arginina AGA e AGG sono molto rari in E. coli, ma molto comuni negli eucarioti). Possibile soluzione: cambiare questi codoni nel codone CGC, preferito da E. coli, oppure co-esprimere il gene per il tRNA Arg(AGG/AGA) Differenze nelluso dei codoni tra procarioti ed eucarioti può avere un impatto sulla produzione di proteine eterologhe in E. coli (ad es. i codoni arginina AGA e AGG sono molto rari in E. coli, ma molto comuni negli eucarioti). Possibile soluzione: cambiare questi codoni nel codone CGC, preferito da E. coli, oppure co-esprimere il gene per il tRNA Arg(AGG/AGA) Stabilità delle proteine: uso di mutanti defettivi per proteasi Stabilità delle proteine: uso di mutanti defettivi per proteasi