Ingegneria animale e animali transgenici Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010 Ingegneria animale e animali transgenici

Manipolazione genetica tradizionale

Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE

Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a quella moderna? 1967: Scoperta della DNA ligasi 1968: Scoperta degli enzimi di restrizione 1972: Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di plasmidi

Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

Metodi di Ingegneria animale

Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale Transgenesi standard 1 Gene Targeting 2 Clonazione 3

Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata Transgenesi standard 1 Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata SCOPO: Guadagno di funzione CARATTERISTICA: inserzione random, casuale

Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due pronuclei della cellula uovo fecondata

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Cocktail ormonale per la superovulazione: PMS (pregnant mares serum) HCG (human chorionic gonadotropin) Raccolta degli oociti fecondati Accoppiamento ♀ ♀ ♀ ♂

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Costruzione del transgene Amplificazione del transgene Purificazione del transgene

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida ♀ 100-200X ♀ pseudogravida ♂ vasectomizzato

La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Estrazione DNA dalle code della progenie Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot M C 1 2 3 4 5 C 1 2 3 4 5

L’inserzione del transgene è casuale RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA Non si sa dove si è localizzato il transgene; Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione; Guadagno di funzione o perdita di funzione? “Incrociamo le dita!!”

Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells Gene Targeting 2 Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells SCOPO: Perdita o modifica di funzione CARATTERISTICA: inserzione mirata

La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene targeting AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA X X AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA Gene inattivo

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti Preparazione del transgene Sequenze di ricombinazione Omologa Neor – resistenza alla Neomicina Tk - thymidine kinase Gene non attivo Elettroporazione

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Trattamento con neomicina e ganciclovir No integrazione X Gene non attivo Sequenze di ricombinazione Omologa Integrazione sito-specifica (1/1000) Tk - thymidine kinase Neor – resistenza alla Neomicina Integrazione random X

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie ES inserite in una blastocisti di topo nero

La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Topo “chimera”

L’inserzione del transgene è mirata RICOMBINAZIONE OMOLOGA Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene; Problemi: espressione tempo e spazio specifica? “Obiettivo raggiunto!”

Clonazione 3 Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer

Il materiale genetico viene copiato in toto Nuclear Transfer Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere ingegnerizzate prima del reimpianto.

Altre tipologie di Ingegneria animale

Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in ingegneria animale Knockout condizionali 1 Animali reporter 2

1 Knockout condizionali Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.

Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE Gene da excidere

Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica: topi LID (liver IGF1 specific deficient) Esone 4 Cre X LoxP Promotore dell’albumina X CRE CRE 80% IGF-I plasmatico

Animali reporter 2 Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare

La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi Sequenze regolatorie Gene ESOGENO Emivita breve Facilmente detectabile

Esempio: il topo reporter ERE-Luc MAR ERE X2 Tk Luciferasi MAR Transgene inserito nel topo ERE-Luc

Applicazioni pratiche dell’ Ingegneria animale

1 2 3 4 5 Studio di funzione genica (ricerca di base) Transgenesi standard Gene targeting Clonaggio KO condizionale Animale reporter Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Modelli di patologia umana 2 Produzione di biofarmaci 3 Screening di farmaci 4 Produzione di organi per xenotrapianti 5

Delezione di un gene tramite gene targeting Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard Delezione di un gene tramite gene targeting Palmiter et al, Nature, 1982

ESTROGEN RECEPTOR KNOCKOUT MICE Couse & Korach, Endocrine Reviews, 1999

2 Modelli di patologia umana Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard: Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità β-globina umana: talassemia Recettore LDL: aterosclerosi APP umana: morbo di Alzheimer Delezione di un gene tramite gene targeting: Apolipoproteina E: aterosclerosi Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher CFTR umana: fibrosi cistica […]

Esempio: modelli di overespressione di APP umana per lo studio della malattia di Alzheimer Lord A, Neurobiol Aging, 2006

3 Produzione di biofarmaci + Emoglobina + Insulina + tPA + GH Produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici

Pro/contro del “biopharming” Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule. Costo Adattabilità alle richieste Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale Raccolta: facile purificazione dal latte Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici Attesa della lattazione Inserzione casuale: può causare problemi all’animale http://www.biotechlearn.org.nz/focus_stories/transgenic_cows/transgenic_cows_making_therapeutic_proteins

Screening di farmaci 4 L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo The mammary gland is the preferred production site, mainly because of the quantities of protein that can be produced in this organ using mammary gland-specific promoter elements and established methods for extraction and purification of that protein (Meade et al., 1999; Rudolph, 1999). Products derived from the mammary gland of transgenic goats and sheep, such as antithrombin III (ATIII), α-antitrypsin or tissue plasminogen activator (tPA) , have progressed to advanced clinical trials (Kues and Niemann, 2004).  would allow the recovery of the product in a conventional way (i.e., by milking), without exerting any adverse effects on the animals. The efficiency with which mammary glands synthesize proteins is enormous. The concentration of endogenous milk proteins is in the order of 4-6%, depending on the species. REPORTER Promotore attivato

Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere lo screening di farmaci? Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni Permettere la misurazione della minima dose efficace Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche

Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale

Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico

Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi Produzione di organi per xenotrapianti 5 Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi X Rigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)

Un maiale ci salverà??