CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2008-09 Adriana Maggi BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE n° 5 siRNA

Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI FARMACI TRADIZIONALI DNA duplicato DNA RNA PROTEINA Duplicazione Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione

ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con l’RNA nella interazione tra RNA e proteina) DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nell’interazione DNA- proteina) siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica: sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

In 1998 Fire and Mello described the presence of si RNA in C.elegans The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"                          In 1998 Fire and Mello described the presence of si RNA in C.elegans Nel 2001 Tuschl et al. dimostrano che una piccola sequnza di RNA puo’ interferire in modo specifico con la trascrizione Andrew Z. Fire Craig C. Mello University of Massachusetts Stanford University b. 1959 b. 1960

Interferenza basata su RNA (RNA interference) Attori: Micro RNA (miRNA) precursori a forcina Ribonucleasi DICER Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti) RISC RNA RNA driven interference silencing complex che comrende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso 8° 10-11 nt risptto al terminale 5’.

Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.

Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the                                                                       Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the Ribonuclese complex hydrolizes new targets

LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA Nature Reviews Genetics 2007, 8:884

RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

RNA interference-mediated heterochromatin assembly siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group. Figure 2 | RNA interference-mediated heterochromatin assembly. Tandem repeats or multiple copies of transposable elements in heterochromatin generate dsRNAs, or those that can be converted to a double-stranded form, through the activity of RNA-dependent RNA polymerase (RdRP). The dsRNA is cleaved by Dicer to produce small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group. Marjori A. Matzke & James A. Birchler Nature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005

Attività di siRNA a livello del nucleo Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali) Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazioe di eterocromatina) Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

RNA lungo a doppio filamento shRNA plasmidico miRNA endogeno siRNA sintetico a doppio filamento 20-25 NT Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex) Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi Complesso RISC attivato funzione miRNA funzione siRNA Blocco traduzione Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

si RNA – caratteristiche RNA a doppia elica di 21-23 nt Presenza di terminale 3’ più lungo di 2nt Presenza di gruppi OH in 3’ Presenza 5’ fosfato Alta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC) Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA) Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi 2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche Non deve essere complementare a zone introniche Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

si RNA – caratteristiche

In rosso: siRNA marcato In blu: nuclei In verde la proteina GAPDH CELLULE HELA si RNA non specifico si RNA contro GAPDH Trattamento: 48h

siRNA come agenti terapeutici LA DISTRIBUZIONE Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari Degradabilità dovuta a Rnasi circolanti (RNA naturale puo’ essere utlizzato in cervello e polmoni) Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale Somministrazione sistemica: iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier) RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA a della cellula bersaglio

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso) fosforotionati per bloccare esonucleasi coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

BIODISTRIBUZIONE

Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*, Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†, Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay* Nature, 2002

siRNA IN STUDI CLINICI

Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso Similarità: - lunghezza - metodologia di delivery comune - induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale - digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi - possibilità di stabilizzzione con basi modificate - similarità nella biodistribuzione Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento - maggiore stabilità della molecola naturale - maggiore efficacia in cellule in coltura - meccanismo di azione mediato da RISC

Riferimenti bibliografici Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884 Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556 Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic adminitrtion. Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142 Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138 (February 2009)