In clinica, il termine “emolisi” non indica il momento della distruzione del globulo rosso; riassume, invece, tutti i meccanismi, diretti o indiretti, che riducono la vita media degli eritrociti. Sebbene una componente emolitica sia presente in molti tipi di anemia (basti pensare alla “eritropoiesi inefficace”), nelle a.e., la ridotta vita media dei globuli rossi si accompagna a una normale capacità di risposta eritropoietica midollare: il midollo va incontro a iperplasia fino a raggiungere tassi di produzione 6-8 volte superiori alla norma. Tale risposta garantisce un numero di eritrociti circolanti pressoché normale anche se la vita media dei globuli rossi si riduce del 60% (“malattia emolitica compensata”) .

Figure 13-3 Marrow smear from a patient with hemolytic anemia Figure 13-3 Marrow smear from a patient with hemolytic anemia. The marrow reveals greatly increased numbers of maturing erythroid progenitors (normoblasts). (Courtesy of Dr. Steven Kroft, Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas, TX.)

Meccanismi generali dell’emolisi: Invecchiamento precoce dei globuli rossi Progressivo traumatismo degli eritrociti nel passaggio attraverso il microcircolo “Emolisi intravascolare”: le emazie si dissolvono (si “lisano”) nel torrente circolatorio “Emolisi extravascolare”: sequestro delle emazie (variamente alterate) nei sinusoidi splenici e epatici e conseguente fagocitosi da parte dei macrofagi

UNA CLASSIFICAZIONE DELLE ANEMIE EMOLITICHE Difetti intrinseci al globulo rosso 1) Alterazioni della membrana eritrocitaria: sferocitosi ereditaria, ellissocitosi. 2) Deficit enzimatici del globulo rosso: enzimi glicolitici (piruvato-chinasi; esochinasi); enzimi dello shunt degli esoso-monofosfati (G6P-deidrogenasi, glutatione sintetasi). 3) Disturbi della sintesi di emoglobina: ridotta sintesi di globina (sindromi talassemiche); sintesi di globine anomale (anemia falciforme, emoglobine instabili) 4) Emoglobinuria parossistica notturna

B) Difetti estrinseci al globulo rosso 1) Anemie immuno-emolitiche: da alloanticorpi (incompatibilità AB0, incompatibilità Rh); da autoanticorpi (numerose cause) 2) Traumi meccanici alle emazie: anemie emolitiche microangiopatiche (CID); anemie emolitiche traumatiche cardiache 3) Infezioni: malaria 4) Agenti chimici: intossicazione da piombo 5) Sequestro dei globuli rossi nel sistema del fagocita mononucleato (ipersplenismo)

La sferocitosi ereditaria è una malattia autosomica dominante causata da mutazioni nei geni delle proteine citoscheletriche del globulo rosso (spectrina, proteina 4.2, beta-adducina, banda 3, proteina 4.1, ankirina). L’indebolimento del legame della foglietto lipidico al citoscheletro provoca un progressivo deterioramento della membrana e il globulo rosso non è più capace di mantenere la sua forma. Questi sferociti passano con difficoltà attraverso i cordoni splenici e vengono eliminati dai macrofagi residenti. A riprova di tale meccanismo patogenetico, la splenectomia (anche parziale) migliora notevolmente il quadro e evita lo sviluppo di complicazioni (coleletiasi e crisi aplastiche) .

Figure 13-2 Schematic of splenic sinus (electron micrograph) Figure 13-2 Schematic of splenic sinus (electron micrograph). A red cell is in the process of squeezing from the red pulp cords into the sinus lumen. Note the degree of deformability required for red cells to pass through the wall of the sinus.

Figure 13-4 Schematic representation of the red cell membrane cytoskeleton and alterations leading to spherocytosis and hemolysis. Mutations weakening interactions involving α-spectrin, β-spectrin, ankyrin, band 4.2, or band 3 all cause the normal biconcave red cell to lose membrane fragments and adopt a spherical shape. Such spherocytic cells are less deformable than normal and therefore become trapped in the splenic cords, where they are phagocytosed by macrophages.

Figure 13-5 Model of the pathophysiology of hereditary spherocytosis Figure 13-5 Model of the pathophysiology of hereditary spherocytosis. (Adapted from Wyngaarden JB, et al [eds]: Cecil Textbook of Medicine, 19th ed. Philadelphia, WB Saunders, 1992, p. 859.)

Gli sferociti (frecce), riconoscibili per la mancanza della zona chiara centrale, si ritrovano in diverse forme di anemia emolitica.

Figure 13-8 G6PD deficiency: effects of oxidant drug exposure (peripheral blood smear). Inset, Red cells with precipitates of denatured globin (Heinz bodies) revealed by supravital staining. As the splenic macrophages pluck out these inclusions, "bite cells" like the one in this smear are produced. (Courtesy of Dr. Robert W. McKenna, Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas, TX.)

Figure 13-6 Hereditary spherocytosis (peripheral smear) Figure 13-6 Hereditary spherocytosis (peripheral smear). Note the anisocytosis and several dark-appearing spherocytes with no central pallor. Howell-Jolly bodies (small dark nuclear remnants) are also present in red cells of this asplenic patient. (Courtesy of Dr. Robert W. McKenna, Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas, TX.)

Anemie emolitiche causate da infezioni degli eritrociti Protozoi Malaria (110 milioni di nuovi casi /anno) Babesiosi (500 casi in USA) altre Batteri Bartonellosi (Perù, Colombia, Equador)

The malaria parasite life cycle involves two hosts The malaria parasite life cycle involves two hosts. During a blood meal, a malaria-infected female Anopheles mosquito inoculates sporozoites into the human host . Sporozoites infect liver cells and mature into schizonts , which rupture and release merozoites . (Of note, in P. vivax and P. ovale a dormant stage [hypnozoites] can persist in the liver and cause relapses by invading the bloodstream weeks, or even years later.) After this initial replication in the liver (exo-erythrocytic schizogony ), the parasites undergo asexual multiplication in the erythrocytes (erythrocytic schizogony ). Merozoites infect red blood cells . The ring stage trophozoites mature into schizonts, which rupture releasing merozoites . Some parasites differentiate into sexual erythrocytic stages (gametocytes) . Blood stage parasites are responsible for the clinical manifestations of the disease. The gametocytes, male (microgametocytes) and female (macrogametocytes), are ingested by an Anopheles mosquito during a blood meal . The parasites’ multiplication in the mosquito is known as the sporogonic cycle . While in the mosquito's stomach, the microgametes penetrate the macrogametes generating zygotes . The zygotes in turn become motile and elongated (ookinetes) which invade the midgut wall of the mosquito where they develop into oocysts . The oocysts grow, rupture, and release sporozoites , which make their way to the mosquito's salivary glands. Inoculation of the sporozoites into a new human host perpetuates the malaria life cycle.

Le più comuni alterazioni in corso di anemia emolitica Nel sangue: Anemia Reticolocitosi con normocitosi (esame morfologico) In certi casi, sferocitosi e schistocitosi Nel plasma: Aumento della bilirubina coniugata e non coniugata Aumento della lattico-deidrogenasi Riduzione dell’aptoglobina Emoglobinemia Nelle urine: Emoglobinuria Cilindruria con emosiderinuria bilirubinuria Negli organi: splenomegalia, epatomegalia Sistemiche: ittero

Gli schistociti (frecce) sono caratteristici dell’anemia emolitica microangiopatica

Le alterazioni in corso di anemia emolitica Nel sangue: Anemia Reticolocitosi con normocitosi (esame morfologico) In certi casi, sferocitosi e schistocitosi Nel plasma: Aumento della bilirubina coniugata e non coniugata Aumento della lattico-deidrogenasi Riduzione dell’aptoglobina Emoglobinemia Nelle urine Emoglobinuria Cilindruria con emosiderinuria bilirubinuria Sistemiche: Ittero, emocromatosi secondaria D’organo: Splenomegalia, alterazioni scheletriche, colelitiasi,

Figure 13-15 Thalassemia: x-ray film of the skull showing new bone formation on the outer table, producing perpendicular radiations resembling a crew-cut. (Courtesy of Dr. Jack Reynolds, Department of Radiology, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas, TX.)

Un esempio paradigmatico dei due principali meccanismi di emolisi: le anemie emolitiche alloimmunitarie. - Le reazioni trasfusionali alloimmunitarie (emolisi prevalentemente intravascolare) La malattia emolitica del neonato (emolisi prevalentemente extravascolare)

KARL LANDSTEINER (1868-1943) Premio Nobel 1930 per la scoperta dei gruppi sanguigni

Struttura e biosintesi dei principali antigeni dei gruppi sanguigni

R-OH R-O-oso GLICOSILTRANSFERASI UDP-oso UDP R-OH = ceramide nei glicolipidi; serina o treonina nelle glicoproteine (o R-NH2 dell’asparagina) Oso = glucosio (Glc), galattosio (Gal), fucosio (Fuc), n-acetilglucosamina (GlcNAc), n-acetil-galattosamina (GalNAc), acido sialico o n-acetilneuraminico (NeuAc)

Sintesi delle catene oligosaccaridiche di specificità A,B, H Reazione 1 Reazione 2 La sequenza 1 2 è obbligatoria: le transferasi A e B non agiscono sulle catene del precursore

R R R R Gruppo A precursore Galb1-4GlcNAc Sostanza H (gruppo 0) a1,3-N-acetilgalatto- saminil transferasi a-1,2 fucosil transferasi Gruppo A R R precursore a1,3-galattosil transferasi Galb1-4GlcNAc Sostanza H (gruppo 0) R Gruppo B

6 4 5 2 1 b-D-galattosio 3 a-D-galattosio

Le basi molecolari del sistema dei gruppi AB0 I geni A e B differiscono tra loro per la sostituzione di poche basi; di conseguenza, la N-acetilgalattosaminiltransferasi (A) differisce dalla galattosiltransferasi (B) per non più di 4 aminoacidi situati in punti chiave dell’enzima, cosicché esso cambia specificità di substrato. Il gene presente negli individui di gruppo 0 è identico al gene A, ma presenta la delezione di una base (guanina 285). Tale delezione comporta il riarrangiamento di tutta la sequenza genetica e la proteina risultante è inattiva sulla sostanza H.

Type 1 bGal (1 3) bGlcNAc-CH2) Type 2 bGal (1 4) bGlcNAc-CH2) 3 2 3 2 Raffronto tra l’accessibilità del gruppo idrossile (indicato dalla freccia) del carbonio 2 del galattosio terminale (rosso) nella catena precursore di tipo 1 e in quella di tipo 2. Il gruppo acetile della glucosamina subterminale (blu) limita l’accesso al gruppo idrossile nelle catene di tipo 1, mentre consente un miglior accesso nelle catene di tipo 2. Pertanto, la fucosiltransferasi 2 (attiva sulle catene di tipo 1) deve essere diversa dalla fucosiltransferasi 1 (attiva sulle catene di tipo 2).

Le basi molecolari del gruppo Secretore Fenotipo Epiteli Nome Eritrociti secernenti Genotipo Secretore H-positivo H-positivo H/H, SE/- Non secretore H-positivo H-negativo H/H, se/se Para-Bombay H-negativo H-positivo h/h, SE/- Bombay H-negativo H-negativo h/h, se/se La sostanza H degli eritrociti (precursore tipo II) è sintetizzata dalla fucosiltransferasi I La sostanza H degli epiteli (precursore di tipo I) è sintetizzata dalla fucosiltransferasi II

Positività a anti- probabile antigeni D C E c e genotipo Rh(D) + (85%) + + 0 + + CDe/cde CDce + + 0 0 + CDe/Cde CDe + 0 + + + cDE/cde cDEe + 0 + + 0 cDE/cDE cDE + + + + + CDe/cDE CcDEe + 0 0 + + cDe/cde cDe Rh(D) – (15%) 0 0 0 + + cde/cde ce 0 + 0 + + Cde/cde Cce 0 0 + + + cdE/cde cEe 0 + + + + Cde/cdE CcEe

La risposta anticorpale agli antigeni dei gruppi sanguigni

La positività del test di Coombs diretto la si osserva in seguito a: Reazioni trasfusionali emolitiche Malattia emolitica del neonato Anemie emolitiche autoimmuni “Sindrome del linfocita trasportato” (anticorpi specifici per i g.r. prodotti da linfociti presenti in un trapianto d’organo) Ipergammaglobulinemie (adsorbimento aspecifico di gammaglobuline alla superficie del globulo rosso)

I

Il test di Coombs indiretto si utilizza in caso di: Ricerca di anticorpi nel siero (per esempio, alloanticorpi nella madre Rh-negativa); Tipizzazione degli eritrociti (mediante l’uso di anticorpi primari a specificità nota); Cross-matching (in caso di trasfusione, dopo aver accertato il gruppo di un paziente, può essere necessario cimentare gli eritrociti da trasfondere con il siero del paziente per scoprire eventuali ulteriori reattività).

Reazioni trasfusionali emolitiche da incompatibilità AB0 Reazione anafilattoide: attivazione del complemento con conseguente liberazione di amine vasoattive e produzione di anafilotossine. Febbre: complessi antigene-anticorpo che inducono la liberazione di citochine dai macrofagi. Dolore diffuso: occlusione vascolare disseminata causata dalle emazie agglutinate. Coagulazione intravascolare disseminata: attivata dai complessi immuni e dalla superficie dei globuli rossi lisati. Insufficienza renale acuta (necrosi corticale bilaterale): vasocostrizione renale, CID e ipotensione.

La malattia emolitica del neonato Può insorgere in neonati D+ la cui madre D- sia stata immunizzata con antigeni D (globuli rossi D+). Rara la alloimmunizzazione trasfusionale, è frequente quella durante la gravidanza: ogni mese, 0.5-1.0 ml di eritrociti fetali (D+) entrano nel circolo materno, ma i livelli anticorpali più elevati si raggiungono quando l’emorragia transplacentare supera i 3 ml (perdita della barriera placentare). Il 15% delle madri D- sviluppa anticorpi nel corso della prima gravidanza, e la percentuale sale molto nelle gravidanze successive. Le IgG anti-D superano la placenta interagendo con i recettori placentari per la porzione Fc. Il trasferimento al feto è lento (settimane) e, pertanto, se gli anticorpi compaiono durante l’ultimo mese, il feto non ne risente.

La malattia emolitica del neonato 2 Alla nascita, la maggior parte dei bambini colpiti presenta una anemia di grado modesto, forse perché i macrofagi residenti sono immaturi. In quattro ore, tuttavia, la distruzione degli eritrociti accelera grandemente, e i livelli di Hb possono calare anche di 3-4g/dl/giorno. La caduta della concentrazione dell’Hb rappresenta un potente stimolo all’emopoiesi (anche extramidollare) con liberazione in circolo di eritroblasti in tutti gli stadi maturativi, reticolociti, e sferociti. Frequentemente, si sviluppa una leucocitosi e, talvolta, una piastrinopenia.

La malattia emolitica del neonato 3 L’encefalopatia da bilirubina L’ittero compare soltanto dopo il parto, perché si perde la capacità escretoria della placenta e la glucoroniltransferasi epatica non è ancora matura. La bilirubina cresce al ritmo di 10 mg/dl al giorno e, quando eccede la capacità di legame dell’albumina (20mg/dl), la bilirubina non coniugata e libera supera la barriera emato-encefalica (spesso incompleta, specie nei prematuri) e raggiunge il SNC. Particolarmente colpiti sono i nuclei della base e il cervelletto (kernicterus). L’idrope fetale Talvolta insorge uno stato di edema generalizzato, accompagnato da gravissima epatosplenomegalia con ipertensione portale e ipoalbuminemia (probabilmente le cause principali). La gran parte dei bambini idropici muore prima del parto e soltanto il 15% dei nati sopravvive.

Prevenzione: somministrazione di 300 mg di IgG anti-D alla madre nel corso della ventottesima settimana di gravidanza. Il meccanismo della soppressione della risposta anti-D in seguito alla immunizzazione passiva non è noto.

CLASSIFICAZIONE DELLE ANEMIE IMMUNOEMOLITICHE Anemie emolitiche alloimmunitarie Reazioni trasfusionali emolitiche Malattia emolitica alloimmune del neonato Anemie emolitiche autoimmunitarie Emolisi mediata da anticorpi “freddi” Emolisi mediata da anticorpi “caldi” primitive e secondarie

Anticorpi “freddi”: si tratta, di solito, di IgM capaci di legarsi all’antigene a 0°C, ma la cui affinità decresce con l’aumentare della temperatura, tanto che a 30°C il tasso di dissociazione è più alto di quello di associazione. Pertanto, l’agglutinazione e l’attivazione del complemento avvengono soltanto quando il sangue passa attraverso i vasi superficiali, dove si raffredda. Una volta che il complesso anticorpo-globulo rosso torna nei vasi più interni, l’anticorpo si stacca e sulla superficie della cellula rimangono dei residui di C3 inattivati. Anticorpi “caldi”: si tratta, di solito, di IgG delle sottoclassi IgG1 e IgG3 che si legano prontamente con l’antigene alla temperatura corporea. Questi anticorpi di solito non provocano agglutinazione (dipende dall’antigene: spesso è un peptide del sistema Rh, ma sono stati osservati gli antigeni più diversi) e non attivano mai il complemento. Tuttavia, rappresentano delle formidabili opsonine (specialmente le IgG3) perché i macrofagi, sia splenici che epatici, possiedono recettori specifici per la porzione Fc.

A) Mediate da anticorpi “freddi” ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI A) Mediate da anticorpi “freddi” 1) Malattia da agglutinine fredde primitiva 2) Malattia da agglutinine fredde secondaria - Infezioni polmonite da micoplasmi mononucleosi infettiva altre - Malattie linfoproliferative - Emoglobinuria parossistica da freddo

La malattia da agglutinine fredde Forma primaria Si tratta di una malattia degli anziani che si presenta con crisi di cianosi dolorosa ai tessuti periferici in seguito all’esposizione al freddo. L’acrocianosi è dovuta all’occlusione arteriolare da parte delle emazie agglutinate. L’anemia emolitica è di solito cronica e di grado lieve; soltanto occasionalmente si possono avere crisi emolitiche gravi (fino a necessitare di trasfusioni) nei casi con titoli anticorpali elevati e in seguito all’esposizione al freddo. Forma secondaria Malattie infettive: in corso di mononucleosi, influenza, parotite, il titolo di agglutinine fredde sale soltanto nell’1% dei pazienti; in corso di polmonite da micoplasmi, un aumento del titolo lo si osserva nell’82% dei casi, ma soltanto in pochi casi si hanno titoli abbastanza alti da indurre crisi emolitiche gravi. Il titolo anticorpale si abbassa spontaneamente nell’arco di un mese, e la malattia si estingue. Malattie linfoproliferative (linfomi, LLC, altre): i titoli di agglutinine non calano spontaneamente dato che si tratta di anticorpi monoclonali prodotti dal clone linfocitario neoplastico. Il titolo può essere elevato, ma l’anemia è in genere di grado modesto. Tutti i pazienti con malattia da agglutinine fredde cronica devono essere controllati per la presenza di una forma latente di linfoma (si arriva al 30% di positività).

Striscio di sangue preparato da un paziente con malattia da agglutinine fredde. Il sangue non è stato mantenuto a 37°C durante la preparazione del vetrino, e il conseguente legame degli autoanticorpi (IgM) ha determinato l’agglutinazione degli eritrociti. L’aspetto omogeneo (tipo sferociti) delle emazie agglutinate è un artefatto: se il sangue viene riscaldato (prima di eseguire il preparato), le cellule si staccano e riassumono l’aspetto normale.

Caratteristiche delle malattie da agglutinine fredde Condizione Specificità Titolo* Clonalità** Emolisi Normale anti I, i, H <50 poli nessuna Primaria anti I 103-106 mono da modesta a grave Post-infettive anti I, i 102-104 poli da nessuna a grave Malattie linfo- Anti I, i, Ii 102-106 mono da modesta a grave proliferative *Reciproco della massima diluizione attiva ** Anticorpi policlonali (poli); anticorpi monoclonali (mono)

A) Mediate da anticorpi “freddi” ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI A) Mediate da anticorpi “freddi” 1) Malattia da agglutinine fredde primitiva 2) Malattia da agglutinine fredde secondaria - Infezioni polmonite da micoplasmi mononucleosi infettiva altre - Malattie linfoproliferative - Emoglobinuria parossistica da freddo

Emoglobinuria parossistica da freddo Oggi, è una rara complicazione di malattie infettive virali (morbillo, parotite, mononucleosi). Le crisi emolitiche precipitano quando il paziente viene esposto al freddo (basta l’immersione di un braccio in acqua fredda) e possono essere violentissime, spesso massive, seguite da dolori muscolari, brividi, febbre (come in una crisi emolitica da incompatibilità AB0). Nel sangue, si osservano tutti i segni dell’emolisi intravascolare, quali emoglobinemia, metaemoglobinemia e metemoalbuminemia. I leucociti fagocitano così attivamente le emazie opsonizzate che esplodono e si può avere una leucopenia transitoria (seguita da leucocitosi). L’anticorpo responsabile è una IgG che reagisce, a temperature di solito inferiori ai 20°C, con gli antigeni eritrocitari P e P1.

Biosintesi dei glicolipidi del sistema P

Gruppo P Fenotipo Frequenza Antigeni Anticorpi eritrocitari sierici P1 75% P, P1, Pk nessuno P2 25% P, Pk anti-P1 P1k raro P1, Pk anti-P P2k raro Pk anti-p, anti-P1 p raro nessuno anti-P1, P, Pk

Anticorpo di Donath-Landsteiner Si tratta di una IgG specifica per il gruppo P che si lega a temperature inferiori a 20°C. Poiché l’antigene è molto rappresentato sulla superficie dei globuli rossi, C1q riesce a legarsi, e quando il sangue raggiunge la temperatura di 25-30°C si ha l’emolisi – intravascolare - anche se gli anticorpi si staccano. Tale comportamento bifasico dell’anticorpo lo si riscontra anche in vitro: nel test di Donath-Landsteiner, il sangue si emolizza quando viene prima raffreddato e poi riscaldato a 37°C.

B) Mediate da anticorpi “caldi” ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI B) Mediate da anticorpi “caldi” 1) Anemia immunoemolitica primitiva (50% dei casi) 2) Anemie immunoemolitiche secondarie - Indotte da farmaci (20% dei casi) meccanismo di adsorbimento o “aptenico meccanismo sconosciuto - Malattie linfoproliferative - Tumori di altri tessuti - Malattie autoimmunitarie sistemiche - Infezioni virali - Sindromi da immunodeficienza

Anemie immunoemolitiche da anticorpi “caldi” La concentrazione emoglobinica corpuscolare media può scendere a 5g/100ml in due settimane; La risposta emopoietica può essere così intensa che la conta assoluta dei reticolociti può arrivare a valori di 106/ml; La proliferazione degli elementi midollari può accompagnarsi a una sintesi di DNA così elevata da indurre una carenza relativa di folati; Se la emivita dei globuli rossi si riduce a meno di 2 giorni, l’eritropoiesi non è più sufficiente a compensare le perdite, e la malattia emolitica può essere fatale.

B A

Reazioni immunoemolitiche ai farmaci Meccanismo Adsorbimento o aptenico Sconosciuto Legame del farmaco emazie proteine reazioni plasmatiche crociate (?)1 Farmaco tipico2 penicillina* stibophen** metildopa*** Classe anticorpale IgG; (IgM) IgM; (IgG) IgG Anemia frequente; frequente; rara; modesta variabile variabile 1 In genere, contro antigeni del gruppo Rh 2 Altri farmaci: * derivati della penicillina, cefalotina, streptomicina; ** fenacetina e congeneri, derivati della sulfonilurea, chinidina, PAS, altri; *** levodopa