Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi Lezione 4: Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi BIOCATALISI Dr. Davide Tessaro A. 2008 -2009

Enzimi redox

Le flavine Sono un gruppo prostetico che conferisce all’enzima un colore giallo. Le flavine sono solitamente strettamente legate (anche covalentemente) all’enzima. Possono effettuare redox monoelettroniche (il radicale semichinonico è stabile). Questo permette loro di reagire con l’ossigeno (che è un diradicale). Hanno bisogno di essere rigenerate dopo la reazione.

Rigenerazione con O2 Per esempio: D-ammino acido ossidasi (D-AAO)

D-AAO Enzima per detossificazione D-AA sia endogeni che esogeni Utile per deracemizzazione AAs:

Ancora 7-ACA Enzima: D-AAO da Trigonopsis variabilis, pH 7.3, 25°C 200 t/anno Tempo di residenza: 1.5 h Il prodotto, in presenza del perossido di idrogeno prodotto, decarbossila spontaneamente dando glutaril-7-ACA

Ancora 7-ACA Ad altra fase del processo

Ancora 7-ACA Glutaril amidasi (o acilasi) da E. coli, pH 8.3, 30°C, immobilizzato su carrier sferico 200 t annue Tempo di residenza 1.5 ore Downstream: cristallizzazione

Ancora 7-ACA Vantaggi biocatalisi: no metalli pesanti (Zn) no solv. clorurati no composti infiammabili condizioni blande emissione gas 7.5 kg  1.0 kg smaltimento acque madri: 29 t  0.3 t Costo ambientale ridotto del 90%

Le monoossigenasi Sub + DonH2 + O2  SubO + Don + H2O Catalizzano reazioni del tipo: Sub + DonH2 + O2  SubO + Don + H2O È come se stabilizzassero e facessero reagire l’ossigeno monoatomico

MO: ossidazione eteroatomi Prendiamo, ad esempio, i solfossidi chirali modafinil

MO tipo Baeyer-Villiger Catalizzano reazioni tipo Baeyer-Villiger su composti carbonilici, ne esistono di più tipi. Tipo 1: cofattore NADPH e gruppo prostetico FADH2 Intermedio tipo Criegee

BV-MOs: il processo Due enzimi consecutivi con riciclo cofattori:

BV-MOs: prodotti Lattoni “normali” Lattoni “anormali”

BV-MOs: un esempio 25% e.e. 74% 30% e.e. 95%

MO per idrossilazione fenoli Esempio: processo Fluka Whole cells in ambiente acquoso Substrato e prodotto sono molto tossici per le cellule: vanno mantenute basse conc. (processo fed-batch). Inoltre, il prodotto polimerizza spontaneamente. Si utilizza una resina adsorbente (XAD-4, polistirenica) in un “letto flluidizzato”. Il prodotto viene liberato dalla resina tramite lavaggio con etanolo acidificato per venire poi cristallizzato da n-esano. Altri prodotti:

MO per idrossilazione fenoli Capacità: 300 L Tempo di residenza: 10 h Loop: 10 (Vreatt/h) Conv. 97%, resa 83%, selettività 85%, purezza 77% (98% dopo XX) STY: 8 g/(L*d) Catecoli 3-sostituiti: intermedi per farmaceutici e chimica supramolecolare

MO CytP450 dipendenti Catalizzano C-H  C-O-H

CytP450-MO: esempi

MO per epossidazione alcheni Di solito non si usano enzimi isolati: sono delicati e richiedono NAD(P)H come cofattore (necessità riciclo) I prodotti sono altamente reattivi, e quindi tossici per la cellula La cellula, facilmente, esprime anche attività di epossido idrolasi È necessaria, quindi, molta accortezza nel design del sistema: si utilizza un’altra fase (solvente apolare) per mantenere basse le conc. delle sostanze e per controllare il decorso della reazione

MO per epox: esempi Processo Nippon mining Catalizzatore: whole cells di Nocardia corallina B276, T = 30°C Range substrati:

MO per epox: esempi Processo Nippon mining Conv: fino al 98% Resa: fino al 92% Selettività: fino al 94% e.e.: 80-97% STY: > 0.2 mol / (L*d)

MO per epox: esempi Processo Nippon mining Uso dei prodotti:

MO per epox: esempi Processo Shell-Brocades Whole cells di Pseudomonas oleovorans T = 37°C Conc = 7 g/L e.e.P > 99.9% Precursori di beta bloccanti

Diossigenasi È come se stabilizzassero e facessero reagire la molecola di O2 in stato di singoletto

Diossigenasi su aromatici Pathway di degradazione aromatici nei procarioti. Gli eucarioti hanno monossigenasi seguita da epossido idrolasi (già visto). Per sfruttare il potenziale sintetico bisogna bloccare la deidrogenazione del diolo.

Diossigenasi: esempio Esempio: produzione indaco Isatis tinctoria Murex trunculus Indigofera tinctoria

Diossigenasi: esempio Indaco: sintesi chimica

Diossigenasi: esempio Indaco: sintesi biocatalitica (Genencor) Enzima da P. putida Alternativa: enzima da P. mendocina