ELETTROFORESI CAPILLARE L’elettroforesi capillare (CE) consiste in una famiglia di tecniche di separazione che utilizzano dei capillari in silice fusa per separare sistemi complessi di molecole grandi e piccole. In CE vengono utilizzati alti voltaggi e la separazione è funzione della carica e delle dimensioni molecolari.

In dipendenza del tipo di capillare e del mezzo solvente, l’elettroforesi capillare può articolarsi in più tipi di tecniche. Effettuare l’elettroforesi in un capillare di piccolo diametro permette di utilizzare campi elettrici molto elevati poiché i capillari dissipano efficacemente il calore prodotto. Aumentare il campo elettrico significa avere separazioni molto efficienti e ridurre i tempi di separazione.

I capillari hanno generalmente un diametro interno di 50 µm ed una lunghezza di 0.5 ÷ 1 m. Il potenziale applicato va da 20 a 30 kV. A causa del flusso elettroosmotico, tutti i componenti del campione migrano verso l’elettrodo negativo. La quantità di campione iniettata nel capillare è molto piccola: 10 nL. I capillari possono anche essere riempiti di un gel che elimina il flusso elettroosmotico. In questo caso la separazione avviene come una elettroforesi convenzionale, ma la risoluzione è più alta, la sensibilità è maggiore e si può utilizzare un rivelatore posto in serie al capillare.

Il flusso elettroosmotico La superficie del capillare di silice contiene gruppi funzionali carichi negativamente che attraggono ioni positivi. Gli ioni positivi migrano verso l’elettrodo negativo e trascinano con sé anche molecole di solvente. Questo flusso di solvente viene chiamato effetto elettroosmotico. Durante la separazione, molecole non cariche si muovono alla stessa velocità del flusso elettroosmotico (con scarsa separazione). Gli ioni positivi si muovono più velocemente e quelli negativi più lentamente.

ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL (CGE) La separazione si ottiene usando un capillare riempito con una matrice gel, p.es. poliacrilammide reticolata o agarosio; questo permette di separare soluti che hanno un rapporto carica/massa simile, ma diverse dimensioni. Per questo motivo questa tecnica è molto utilizzata per separare macromolecole biologiche.

LA SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa consiste nello studio in fase gassosa di molecole elettricamente cariche a fini analitici come p.es,: Determinazione del peso molecolare Caratterizzazione strutturale Reattività in fase gassosa Analisi qualitativa e quantitativa di componenti di miscele La spettrometria di massa consiste nel separare gli ioni in fase gassosa e la separazione avviene per effetto di campi magnetici o elettrici ed è funzione del rapporto massa/carica (m/z). Le masse sono relative a quelle dell’isotopo 12C, il cui peso atomico è definito = 12. La massa reale del 12C è 12 daltons, dove un dalton è uguale a 1.661 10-24 g.

Per produrre la carica in molecole neutre si possono utilizzare diverse tecniche. Uno dei criteri per scegliere quale utilizzare è quello della termolabilità. Campioni termostabili, e relativamente volatili, possono essere ionizzati mediante impatto elettronico che pero’ produce spesso frammentazione del campione con perdita del picco molecolare. Campioni termolabili (in genere biopolimeri) necessitano di tecniche di ionizzazione “morbida” fra le quali vi sono l’Electrospray (ESI) ed il desorbimento laser assistito da matrice (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation, MALDI).

Electrospray Questa tecnica utilizza un campione liquido che viene nebulizzato e sottoposto ad un shock elettrico attraverso una forte potenziale elettrico. Il processo produce delle goccioline con forte carica elettrica; queste perdono delle molecole cariche durante il percorso attraverso i campi elettrici e/o magnetici e queste molecole vengono poi rivelate misurando il rapporto massa/carica (m/z). La tecnica produce spesso molecole con più di una carica. Si può lavorare sia con ioni positivi (spesso molecole associate a protoni o cationi monovalenti) o con ioni negativi (spesso molecole deprotonate). Generalmente non si ha frammentazione. Vantaggi dell’ESI: - la ionizzazione “morbida” produce molecole intatte. - La produzione di specie con carica multipla permette di analizzare pesi molecolari elevati. - ESI lavora a pressione ambiente e quindi può essere interfacciata con elettroforesi capillare o cromatografia ad alta pressione.

Principio della ionizzazione ESI

Geometria di uno strumento ESI

la mioglobina a diversi gradi di protonazione Esempio la mioglobina a diversi gradi di protonazione

Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI): Introdotta nel 1988, i campioni sono co-cristallizzati con una sostanza che assorbe fotoni nella zona dell’UV (la matrice, p.es. per le proteine si utilizza acido sinapinico ed un laser a 337 nm). Il laser porta il sistema ad uno stato ad energia alta dal quale si desorbono le molecole da analizzare. Non si produce frammentazione e si producono specie con una sola carica. Considerazioni pratiche: -Il rapporto campione/ matrice è 1/5000. -la concentrazione finale di campione è 10 pmol/l acido 3,5-dimetossi-4-idrossi cinnamico

Esempio di spettro di massa MALDI per una miscela di proteine