Sistemi per omogeneizzare e frazionare tessuti e cellule Per poter essere studiati in dettaglio le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari devono essere isolati dal materiale di partenza. IL primo passaggio consiste nella distruzione della struttura cellulare o dei tessuti.

Coltura cellulare o tessuto

1-Scelta del materiale di partenza 2-Metodo di rottura delle cellule 3-Proprietà chimico-fisiche delle soluzioni impiegate.

Metodi per rompere le cellule -metodi blandi: lisi per osmosi digestione enzimatica solubilizzazione chimica omogenizzatori -metodi moderati omogenizzatori a lama mortaio -metodi vigorosi French press Sonicazione Macinazione con microsfere

METODI BLANDI Lisi per osmosi Na+, Ca2+ Shock osmotico K+ Mg2+ Le cellule animali riescono a man- tenere costante la concentrazione intracellulare di soluti scambiando attivamente (consumo di ATP) ioni con l’esterno. K+ Mg2+ Shock osmotico Un abbassamento drastico della pressio- ne osmotica esterna (immersione in acqua distillata) provoca un rigonfiamento delle cellule ed una ‘esplosione’ delle membrane.

Digestione enzimatica Lisi della parete+ shock osmotico Solubilizzazione chimica Sodio dodecil solfato Omogeneizzazione con potter

METODI MODERATI Omogeneizzatori con lama (frullatore) Macinazione con mortaio

SONICAZIONE (ultrasuoni) METODI VIGOROSI French press Camera di compressione Valvola a spillo Pistone PRESSIONE SONICAZIONE (ultrasuoni)

SOLUZIONI Il tampone ideale deve possedere le seguenti qualità: Tamponare a pH vicino alla neutralità Essere altamente solubile. Non penetrare attraverso le membrane (se si studiano organelli). Essere stabile chimicamente ed enzimaticamente Non assorbire luce nelle regioni dello spettro UV-visibile Non essere tossico.

ACIDO O BASE pK note PIPES Acido acetico 4.75 È efficace come tampone solo a pH acidi (4-5.5). Acido citrico 4.76 (pKa2) 6.4 (pKa3) È efficace come tampone a pH <7. Tende a chelare gli ioni polivalenti. MES acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico 6.1 È uno dei cosiddetti ‘Good buffers’ (dal nome di chi ne ha esplorato l’uso in biochimica e biologia cellulare), come anche Bicina, PIPES, HEPES ed altri. Poco tossico per le cellule. Acido carbonico 6.35 (pKa1) 10.3 (pKa2) La forma diprotonata tende a formare CO2. Più utile come tampone per la biochimica, a pH alcalini, lo ione monoacido. PIPES acido 1,4piperazinodietansulfonico 6.8 Relativamente costoso, ma valido. Interagisce pochissimo con i metalli divalenti (Ca2+, Mg2+, Mn2+). Può interferire con il metodo di Lowry per la determinazione della concentrazione proteica. Imidazolo 7.0 Acido fosforico 7.2 (pKa2) 12.3 (pKa3) Poco costoso. È spesso metabolita o inibitore di sistemi enzimatici. Tende a precipitare i cationi polivalenti. HEPES acido N-2-idrossietil-piperazina-N’-2-etansulfonico 7.5 Vedi PIPES. Tris Tris(idrossimetil)aminometano 8.1 Poco costoso e molto usato. Tuttavia può dare effetti inibitori con molti sistemi enzimatici ed interagire fortemente con I metalli di transizione. Il suo pKa varia sensibilmente con la temperatura Bicina N,N’-bis-(2-idrossietil)glicina 8.35 Un ‘Good buffer’. Acido borico 9.2 Forma complessi con gli acidi nucleici. Glicina 9.8 (pKa2)

ALTRI COMPONENTI DEL MEDIUM Ioni Mg2 Composti tiolici (2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo, glutatione, cisteina…) vengono utilizzati per mantenere ridotti i gruppi sulfidrilici delle proteine essenziali). Inibitori di proteasi.. Per gli acidi nucleici, RNA in particolare, occorrerà usare degli inibitori di nucleasi (RNAsina, cocktails di anticorpi specifici per le ribonucleasi, vanadil nucleotidi…).