 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di ISOLARE AMPLIFICARE frammenti di DNA SEQUENZIARE  Perché manipolare i geni? 1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica; 2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione; 3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine; 4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici

PROCEDURA di CLONAGGIO ISOLAMENTO del gene INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso…. …..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI

Cosa serve per un clonaggio Gene (DNA di interesse) Enzimi di restrizione DNA ligasi Vettore Cellula ospite

DNA LIGASI Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente. L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa. CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE: Presenza di ATP 10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore   La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir stabilizzate dalla ligazione. OH P BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’ OH P OH P EcoRI 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’

Transferasi terminale DNA LIGASI OH P FOSFATASI ALCALINA BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAG G-5’ HpaI 5’-GTT AAC-3’ 3’-CAA TTG-5’ Blunt ends ligation oppure trattamento con Transferasi terminale Sticky ends ligation + dATP + dTTP AAA TTT

Vettori di clonaggio Plasmidi Fagi Cosmidi Yac Bac

PLASMIDI Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico, circolare. In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li contengono. Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.  Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere: Dimensioni contenute Un sito di origine della replicazione Un gene per la resistenza a un antibiotico Siti unici di restrizione (polilinker)    

TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE: Inserimento del plasmide nella cellula ospite Cellule competenti Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.

Curva di crescita di E. coli INTERVALLO (Lag phase) I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco. FASE LOGARITMICA 4 - 5 ore I batteri crescono esponenzialmente. 10 - 11 ore FASE STAZIONARIA La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente. Tempo (h) Densità cellulare (OD600) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5 10 15 20

PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO LISI ALCALINA 1. RISOSPENSIONE E. coli 2. LISI NaOH / SDS RNasi DNA cromosomico DNA plasmidico Centrifugazione 3. NEUTRALIZZAZIONE KAc Precipitato contenente DNA genomico, proteine, detriti cellulari Supernatante contenente il DNA plasmidico

...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr DNA cromosomico DNA plasmidico Bromuro d’etidio Svolgimento della doppia elica e diminuzione della densità idrodinamica Svolgimento della doppia elica compensato dall’introduzione di supereliche Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame rendendo la densità idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.

T Prodotto di PCR P OH O Tyr-274 Topoisomerasi

Riepilogo di un procedimento di clonaggio

Libreria genomica Quando si clona l’intero genoma di un organismo si dice che si costruisce una libreria (library) genomica

Libreria di cDNA (DNA complementare) La miscela di frammenti che contiene tutte le sequenze codificanti costituisce la “libreria di cDNA”. 1-Estrazione di mRNA AAAAAAAA TTTTT AAAAA Caricamento Lavaggio Eluizione

2-Sintesi del cDNA (1° metodo) AAAAAAA 3’ mRNA 5’ + oligo dT 3’ TTTTTTT 5’ AAAAAAA 3’ mRNA TTTTTTT 5’ DNA Formazione della forcina AAAAAAA Sintesi del filamento complementare Dna polimerasi cDNAA Rimozione della forcina con la nucleasi S1 + trascriptasi inversa Rimozione del mRNA (degradazione alcalina o calore)

Sintesi del cDNA (2° metodo)

genoma di 1.85 x 108 bp dopo digestione, abbiamo avuto frammenti di circa 20.000 basi che possiamo clonare nel vettore opportuno. Se ogni tratto del genoma fosse presente una sola volta, basterebbero 10.000 cloni per rappresentare tutto il genoma. Esiste una formula che permette di calcolare il numero dei cloni necessari per avere un alta probabilità che tutti frammenti siano rappresentati: n = ln(1-p)/ln(1-f) f = 20.000 bp/185.000.000 = circa 10-4 cioè ogni inserto di 20 kb è 1/10.000 del genoma totale. La probabilità p può essere scelta come 95%, 99%, 99.9% a seconda della sicurezza che si desidera avere. Nei tre casi il numero dei cloni sarà: 30.000, 4-50.000, 70.000

SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA Placche o colonie Punti di riferimento per l’orientazione della replica al termine dell’esperimento • Replica su filtri di nitrocellulosa (conservare le piastre originali) Denaturazione, neutralizzazione e legame del DNA al filtro Ibridizzazione con sonda marcata e lavaggio della sonda non legata 32P Sonda non legata Sonda ibridizzata Autoradiografia Autoradiogramma che mostra la posizione delle sonde ibridizzate Recupero delle placche positive dalla piastra originale

SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla biblioteca. STRATEGIE DI SINTESI: E’ nota la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche (degenerate) più appropriate o si amplifica un frammento del gene di interesse mediante PCR E’ nota la sequenza nucleotidica del gene di interesse CASO 1: CASO 2: Si predice la sequenza nucleotidica che dovrebbe codificare per quella proteina Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come sonda per l’isolamento del corrispondente gene.

Altri vettori di clonaggio Fagi Cosmidi Yac (yeast artificial chromosome) BAC

I fagi (o batteriofagi) sono strutture biologiche complesse in grado di fissarsi alla parete batterica e quindi introdurre il loro DNA all'interno del batterio. (trasfezione) . Il fago più usato e conosciuto è il fago lambda. Il fago l è un fago temperato, ha un peso molecolare di 31.106 Da ed è lungo 48.502 bp

Il DNA isolato da alcune particelle virali è a doppio strand con due estremità a singolo filamento di 12 nucletotidi complementari fra loro, chiamati siti cos. Questi siti permettono al DNA di circolarizzare dopo l’infezione della cellula ospite. 5’ GGGCGGCGACCTCGC---------------------- ACG 3’ GCG---------------------TCGCCCGCCGCTGG La mappa genetica del fago l comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi in tre gruppi funzionali: la parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della testa e della coda. la parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che porta all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori. la parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico (S, R), geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N, Q) (Fig. 33)

CICLO LISOGENICO Ad alto stato di infezione la cellula contiene alte concentrazioni di cIII: Hfl è inibita cII stimola la trascrizione di cI e la proteina Integrasi cI è un repressore dei geni del ciclo litico e blocca la sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori OL e OR, bloccando il ciclo litico CICLO LITICO A basse concentrazioni di cIII: Hfl non inibita riduce l’attività o la quantità di cII blocco della sintesi di cI la sintesi di N, O, P, Q non è più bloccata

LISI E MISCELAZIONE DEGLI ESTRATTI Proteine di assembaggio pD Geni fagici Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione amber BHB2688. L’induzione porta alla produzione di di code di l, di proteina D e delle proteine di assemblaggio, ma non di proteina E. Non si formano i precursori delle teste. amber BHB2690. L’induzione porta alla produzione di di code di l, dei precursori delle teste e delle proteine di assemblaggio, ma non di proteina D. L’impaccamento è impedito a causa della mancnaza di proteina D LISI E MISCELAZIONE DEGLI ESTRATTI + AGGIUNTA DI ATP + DNA CONCATAMENRIZZATO + COS PARTICELLA FAGICA MATURA IMPACCAMENTO IN VITRO

La regione tra i geni J e N del genoma di l non è essenziale per la crescita litica. In linea di principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14.500 bp di DNA estraneo Nella testa del fago può trovare posto fino al 105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di l altre regioni non essenziali che possono essere rimosse. Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA estraneo inseribile. Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di l, pari a circa 37 Kb, al di sotto il DNA non viene impaccato e il l non è vitale. Esistono due tipi di vettori l * I vettori d'inserzione * I vettori di sostituzione

DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO Regione non essenziale (circa 20 Kb) Eliminazione del DNA non essenziale DNA da clonare DNA ricombinante Teste e code del virus Assemblaggio in vitro delle particelle virali Il DNA virale entra nelle cellule, viene replicato e dirige la sintesi delle proteine virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove particelle virali assemblate Recupero delle particelle virali e isolamento del DNA clonato Infezione dei batteri DNA virale Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago l, lungo 49 Kb.

Cicli ripetuti di replicazione con il meccanismo del cerchio rotante IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE Il DNA virale a doppia elica entra nelle cellule batteriche durante l’infezione come molecola lineare Estremità coesive All’interno della cellula, le estremità si appaiano originando una molecola di DNA circolare Sito cos Concatameri di copie di DNA virale Cicli ripetuti di replicazione con il meccanismo del cerchio rotante Il DNA codifica per le proteine della testa e della coda del virus Il DNA viene inserito nelle teste del virus e tagliato a livello del sito cos Sono aggiunte le code Particella virale infettiva. I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e possono infettare altre cellule batteriche. 5’ •

COSMIDI Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle caratteristiche essenziali di un plasmide, anche un SITO COS La presenza di questo elemento è determinante per consentire l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del virus che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per infezione.

c) cosmidi Sono plasmidi che utilizzano la capacità del batteriofago lambda di impacchettare lunghi frammenti di DNA lineare all’interno del capside, di aderire alla superficie delle cellule batteriche e di iniettare il loro contenuto all’interno del batterio. Rispetto al batteriofago lambda, può contenere un inserto di DNA di dimensioni maggiori (45 kb). Il cosmide circolarizza e si comporta come un grande plasmide replicando il proprio genoma.

d) Vettori BAC Bacterial Artificial Chromosome Plasmidi di dimensioni enormi, consentono l’inserimento di frammenti di DNA umano fino a 300 Kb. Il DNA viene inserito nei batteri mediante processo di elettroporazione: uno shock elettrico provoca la formazione transitoria di pori sulla membrana batterica attraverso i quali passa il DNA.

Ospiti per i vettori Le caratteristiche di un ospite di clonaggo sono: crescita rapida capacità di crescere in terreni di coltura poco costosi non patogencità capacità di essere trasformato stabilità della coltura.

Curva di crescita di E. coli INTERVALLO (Lag phase) I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco. FASE LOGARITMICA 4 - 5 ore I batteri crescono esponenzialmente. 10 - 11 ore FASE STAZIONARIA La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente. Tempo (h) Densità cellulare (OD600) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5 10 15 20

Schema di sequenziamento a terminazione di catena DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC 5’ 3’ Ibridazione con Il primer + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -C ddC -CC ddG -CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T G T A C Schema di sequenziamento a terminazione di catena Direzione di lettura