Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo mm.dinardo@biologia.uniba.it

Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le proteine che servono a “fabbricare” un organismo, a farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono responsabili di malattie. Ed è proprio attraverso lo studio del funzionamento delle proteine che si potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….

Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante: Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi); Shock osmotico; Successivi cicli di congelamento/scongelamento; Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi: mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido; mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (Potter-Elvejham). Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto l’attrito sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

Le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono: - la rottura delle cellule in uno specifico buffer; - la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

Campioni proteici Estratti di tessuti o cellule Proteine ricombinanti “etichettate” con antigeni (“tags”: HA, T7) Virus interi purificati Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma) Expression of cloned gene and the analysis of the proteins it encodes, refer to agroinfiltration as carrier Cellular location—may help determine composition of lysis buffer Structural integrity, protease activity

Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) pH Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

Elettroforesi

Analisi elettroforetica delle proteine del siero

La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza): v = Eq/f dove f=6πrη Elettroforesi

Fattori che influenzano la velocità di migrazione CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) TAMPONE (Concentrazione, pH) SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

SUPPORTI Non setaccianti Setaccianti (Carta), acetato di cellulosa Gel di poliacrilammide(PAG) Gel di Agarosio

Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

Elettroforesi di DNA I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide I campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenziale Il DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+” I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente

Elettroforesi di Proteine Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e’ fatto di poliacrilammide

Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell’elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q Proteina R +3 30kD 4 42kD

Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa +3 30kD 4 42kD Carica Massa 300 30kD 420 42kD SDS

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH2 CH3 SDS SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le proteine Aggiunge cariche negative alle proteine

Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

Sistemi per la corsa di SDS-PAGE Amersham Biosciences Bio-Rad Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

Come funziona un Gel SDS-PAGE ? Le proteine cariche negativamente si muovono verso l’elettrodo positivo Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente Le proteine si separano per dimensione SDS, calore s-s Proteine con SDS + –

Cosa c’e’ nel buffer di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

Il Gel E’ costituito da due parti: Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8 Running gel: 8-14% gel separatore, pH 8.8 Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS Discontinuous buffer system The amount of acrylamide determines pore size—in turn affecting how fast the protein will move through the gel Low acrylamide (big pores)- large protein moves fast vs. high acrylamide (small pores)– slower movement Free radicals accelerate polymerization time, TEMED catalyzes the productions of free-radicals (highly reactive, charged, yielding chemical reaction) from APS, approx 30’ to 1hr., will happen w/o, but takes a long time. In chemistry, free radicals are uncharged atomic or molecular species with unpaired electrons or an otherwise open shell configuration. These unpaired electrons are highly reactive, so free radicals are likely to take part in chemical reactions. Free radicals play an important role in combustion, atmospheric chemistry, polymerization, plasma chemistry, biochemistry, and many other chemical processes.

Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8 SDS ddH2O TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS) Pre-cast gels commercially available Acrylamide potent neurotoxin, absorbed through skin…polymerized gel considered nontoxic APS decomposes slowly, prepare fresh for best results

Il Gel Come funziona: Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8 Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) Si muovono verso il gel separatore (“resolving”) Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore Il Gel – Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8 MW markers help with orientation when transferring to membranes, band sizes different depending on gel % and composition, see manufacturer details Proteins are sandwiched between chloride ions from Tris-HCl in the stacker and sample buffer and the glycine molecules from the running buffer forming a thin zone or stack, depositing proteins on the surface of the resolving gel +

Il Gel % di acrilammide consigliata 8% 10% 12% Dimensioni delle proteine 40-200 kDa 21-100 kDa 10-40 kDa

Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu’ usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

Stima dei pesi molecolari kD mm 203 8.5 135 12.0 86 18.5 41 28.0 33 34.0 19 41.5 8 44.5 250 200 150 Dimensioni in kDa 100 50 20 40 60 Distanza (mm dal pozzetto)

Stima dei pesi molecolari

Western Blotting

Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

Cosa e’ un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

A cosa serve il Western Blot? Qual e’ la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo + – ?

Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell’anticorpo primario. (L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario. (L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o “detection”. (L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E’ necessaria l’immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l’esperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana Nitrocellulosa PVDF (Polivinilidene fluoride) Nylon

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento membrana

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si legano alla membrana Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+) Spugnette 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento Gel Membrana Focus on left side of picture

Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

Western Blotting - + SDS-PAGE Assemble ‘sandwich’ Wet blotting Buffer-soaked filter papers Gel Nitrocellulose membrane Wet blotting Electrode Buffer Direction of transfer Semi-dry blotting Graphite Electrode Plates Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau)

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Componenti del tampone di trasferimento: 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo Have your gel/membrane sandwich together, pour in transfer buffer into apparatus, apply current and proteins are transferred from gel to membrane.

3 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

Western blot: terza fase saturazione o “blocking” Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dell’anticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA) reducing background

4 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario L’anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana Anticorpi come sonde: Molto sensibili Possono essere “prodotti” Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) Generando anticorpi monoclonali (mAb) Economici

Anticorpi Ab + Ag AbAg Kd Kd = = 10-9 M [Ab] [AbAg]

Anticorpi Anticorpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza l’antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. There are 5 major classes of immunoglobulins, for example IgG and IgA, IgM, IgD, IgE

Anticorpi policlonali Produzione Immunizzazione ripetuta dell’animale con l’antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il siero Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi dell’antigene usato per l’immunizzazione Animal most common goat, rabbit, mouse Antigen can be virus, protein, synthetic peptide (if you know the sequence) Some antibodies will be specific to injected antigen, mixed with antibodies that have been elicited by antigens throughout the lifetime of the animal

Anticorpi monoclonali Riconoscono solo un epitopo Repeat immunization of animal with antigen Spleen removed, B-cell production, contains genetic information that gives rise to antibody production, each individual cell is making a specific antigen Spleen cells cannot be cultured, fused with myeloma cells that proliferate in vitro Resulting fused cells (hybridoma) screened by ELISA to select antigen specific antibodies, resulting in a monoclonal antibody Once a single hybridoma line is selected, injected into healthy mouse, produces tumor that produces a fluid rich in monoclonal antibodies, called ascites fluid Antibodies are then purified through various methods (Affinity chromotography)

Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

5 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

Anticorpi Anticorpo primario Anticorpo secondario Riconosce la proteina Anticorpo secondario Lega l’anticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell’enzima sara’ convertito in un prodotto colorato Puo’ anche essere radioattivo o fluorescente

Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

6 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

Western blot: sesta fase rivelazione o “detection” Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall’enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati Directly on the gel: Cooblue nonspecifically binds to virtually all proteins, silver stain more sensitive, permanent Alkaline phosphatase (blue) horseradish perox. (brown) AP more commonly used in plants vs. HRP in animals (AP present in all tissues in the body- cross reactive, HRP enzyme derived from plant, so better to use AP in plant applications I 125 a two-step biotin/avidin system may be used. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

HRP Western blot substrato luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

A cosa serve il Western Blot? Quanta proteina di interesse c’e’? Proteina di interesse Bande non specifiche [Proteina], pg