Il Sistema Immunitario

Parassiti nei globuli rossi Batteri Patogeno è qualsiasi organismo dotato del potenziale di provocare una malattia. Divisi in 4 categorie: batteri, funghi, virus, parassiti Patogeno opportunista: colonizza l’organismo senza provocare una malattia. Può divenire patogeno se le difese sono indebolite. Parassiti nei globuli rossi Batteri Fungi SARS virus Because the human body provides an ideal environment for many microbes, they try to pass your skin barrier and enter. Your immune system is a bodywide network of cells, tissues, and organs that has evolved to defend you against such “foreign” invasions. The proper targets of your immune system are infectious organisms--bacteria such as these streptococci; fungi (this one happens to be Candida, the cause of yeast infections); parasites, including these worm-like microbes that cause malaria; and viruses such as this SARS virus.

>umorale (cellule B , anticorpi) L’organismo reagisce all’invasione di un patogeno con due tipi di risposta: -Risposta immunitaria innata -Risposta immunitaria acquisita >umorale (cellule B , anticorpi) >cellulo-mediata (cellule Tc e Th) Il Sistema immunitario deve essere in grado di disitinguere il self dal non-self (tolleranza verso il self)

innata acquisita IMMUNITA’ aspecifica riconosce strutture comuni sempre operativa sempre uguale previene l’infezione specifica riconosce strutture specifiche consegue al contatto potenziata da contatti ripetuti richiede l’infezione

IMMUNITA’ INNATA Comprende 4 tipi di barriere: Anatomica Fisiologica Cute Superficie delle mucose Fisiologica Temperatura pH Fattori solubili Endocitica/fagocitica fagocitosi Infiammatoria Complesso Risposta infiammatoria

Cute: -barriera meccanica ritarda l’ingresso dei microbi - l’ambiente acido(pH 3-5) ne ritarda la crescita Mucose: - la flora normale compete con i microbi per i siti di attacco e i nutrienti -il muco intrappola i microrganismi interi - Le ciglia spingono i microrgansimi fuori dal corpo Temperatura: -la normale t inibisce la crescita di alcuni patogeni -la febbre inibisce la crescita di alcuni patogeni pH: - l’acidità gastrica uccide la maggior parte dei patogeni ingeriti Mediatori chimici: -lisozima scinde la parete batterica -interferone induce uno stato antivirale nelle cellule infettate - Il sistema del complemento lisa i mocrorganismi e facilita la fagocitosi

1-2 adesione del batterio a lunghe evaginazioni della membrana (pseudopodi) 3- ingestione del batterio con formazione del fagosoma che si muove verso il lisosoma 4- fusione del fagosoma e lisosoma con rilascio di enzimi lisosomiali nel fagosoma 5- digestione del materila ingerito 6- rilascio di prodotti di digestione della cellula Fagocitosi

I fagociti sono di due tipi: I fagociti che riconoscono le comuni componenti delle pareti batteriche innescano l’immunità innata e inducono l’infiammazione I fagociti sono di due tipi: Macrofagi Neutrofili I macrofagi sono presenti nei tessuti I neutrofili circolano nel sangue e penetrano solo in quelli infetti Essi espongono recettori di superficie che si legano ai comuni carboidrati della parete batterica, componenti che non sono presenti nella cellula umana In risposta alla presenza dei batteri i macrofagi secernono proteine solubili, dette citochine, che reclutano altre cellule del sistema immunitario. I neutrofili sono cellule specializzate nella fagocitosi e nell’uccisione dei patogeni. Iniziano ad agire subito dopo l’infezione. Sono capaci di agire anche in condizioni di anaerobiosi. Muoiono nel sito di infezione formado pus. Producono l’infiammazione.

INFIAMMAZIONE Il danno tissutale provoca il rilascio di vari fattori vasoattivi e chemiotattici. Questi fattori inducono aumento del flusso sanguigno nell’area, aumento della permeabilità capillare e afflusso dei globuli bianchi, tra cui fagociti e linfociti. Le proteine seriche contenute nell’essudato hanno proprietà antibatteriche e i fagociti incominciano a fagocitare i batteri Tra i principali mediatori chimici ci sono: proteine della fase acuta istamina chinine

Compito del sistema immunitario innato è anzitutto quello di riconoscere e quindi distinguere cellule che fanno parte del self, ovvero cellule proprie dell’individuo, da quelle esterne di origine batterica. Ciò è possibile in quanto tutte le cellule batteriche hanno una caratteristica comune, ovvero quella di concludere l’estremità N-terminale di ogni peptide una formil-metionina al posto di una metionina. Inoltre il sistema immunitario innato è in grado di riconoscere anche la struttura lipopolisaccaridica della parete esterna dei batteri e anche il tipo di acido nucleico presente in essi. La specificità di queste varie capacità di riconoscimento è affidata a particolari recettori detti “toll-like receptors”,proteine la cui origine , si è visto, è molto antica nella scala dell’evoluzione degli organismi viventi.

La famiglia Toll-like receptor (TLR) appartenenti al Pattern di Recettori di Ricognizione Peptidoglycan (G+) Lipoprotein Lipoarabinomannans Zymosan (Yeast) GPI protein LPS(G-) RSV F Bacterial CpG DNA dsRNA Flagellin MD-2 TLR-6 TLR-2 TLR-1 CD14 TLR-4 TLR-3 TLR-5 TLR-9

CELLULE E ORGANI DEL SISTEMA IMMUNITARIO

Il Sistema immunitario: meccanismi di base Componenti del sistema immunitario: organi linfatici e leucociti. Organi linfatici: i leucociti si sviluppano fino alla maturità negli organi linfatici PRIMARI (il midollo osseo e nel caso dei linfociti T, il timo). Gli organi linfatici periferici mostrano un’architettura reticolare che intrappola materiale estraneo presente nel sangue (milza), nella linfa (linfonodi), nell’aria (tonsille e adenoidi) e in cibo e acqua (appendice vermiforme e placche di Peyer nell’intestino). Leucociti: si dividono in neutrofili, monociti e macrofagi (dai monociti), cellule fagocitarie che “inglobano e distruggono” agenti estranei e detriti; gli eosinofili ed i basofili proteggono invece dai grandi parassiti e sono coinvolti nelle reazioni allergiche. Linfociti: si dividono in B (cellule B) e T (cellule T), specifici rispetto agli agenti esterni. I linfociti non B e non T sono “natural killer (NK)” antivirali.

Organi del Sistema immunitario Tonsille e adenoidi Linfonodi Vasi linfatici Timo Linfonodi Milza Placche di Peyer Appendicite Linfo nodi The organs of your immune system are positioned throughout your body. They are called lymphoid organs because they are home to lymphocytes--the white blood cells that are key operatives of the immune system. Within these organs, the lymphocytes grow, develop, and are deployed. Bone marrow, the soft tissue in the hollow center of bones, is the ultimate source of all blood cells, including the immune cells. The thymus is an organ that lies behind the breastbone; lymphocytes known as T lymphocytes, or just T cells, mature there. The spleen is a flattened organ at the upper left of the abdomen. Like the lymph nodes, the spleen contains specialized compartments where immune cells gather and confront antigens. In addition to these organs, clumps of lymphoid tissue are found in many parts of the body, especially in the linings of the digestive tract and the airways and lungs--gateways to the body. These tissues include the tonsils, adenoids, and appendix. Midollo osseo Vasi linfatici

Gli organi linfatici primari forniscono la sede in cui i linfociti differenziano e vengono commissionati per l’antigene. I linfociti T maturano nel timo I linfociti B maturano nel midollo osseo (borsa di Fabrizio negli uccelli) In entrambi i casi un processo selelttivo elimina i linfociti immaturi che riconoscono molecole self oppure riconoscono il MHC autologo

Gli organi linfatici secondari catturano l’antigene e forniscono la sede in cui i linfociti possono interagire con esso, andando incontro alla proliferazione e alla differenziazione in cellule effettrici Il tessuto linfatico drena i tessuti e li intereconnette gli uni agli altri I linfonodi sono specializzati nel catturare gli Ag presenti nei tessuti La milza riceve gli Ag direttamente dal sangue Il tessuto meno organizato si trove nelle membrane delle mucose (follicoli linfatici dispersi nella lamina dell’intestino e nelle placche di Peyer, site nella parete intestinale) Si possono individuare anche tessuti linfatici terziari: tessuti linfatici associati alla cute

NEI TESSUTI SECONDARI AVVIENE L’INCONTRO DEI LINFOCITI CIRCOLANTI CON I PATOGENI E I LORO PRODOTTI METABOLICI TRASPORTATI DA UN SITO DI INFEZIONE

CELLULE

Emopoiesi è il processo che porta alla formazione di cellule del sangue mature. Le sedi dell’emopoiesi sono diverse nel feto, rispetto all’adulto. Nel feto sono organi emopoietici: il sacco vitellino, il fegato, la milza, il timo, il midollo osseo. Nell’adulto il principale organo emopoietico è il midollo osseo delle ossa piatte e delle estremità delle ossa lunghe che produce tutti gli elementi figurati del sangue. Tutti derivano da una cellula capostipite denominata emocitoblasto, capace di differenziarsi poi nelle differenti linee. Emocateresi è il processo che porta alla distruzione della cellule del sangue. Principali organi che svolgono questo ruolo sono il fegato e la milza

Cellule della linea linfatica Linfociti sono il 20-40% dei globuli bianchi e 99% delle cellule presenti nella linfa Nel corpo umano ci sono circa 1011 linfociti Circolano nel sangue e nella linfa e possono migrare nei diversi tessuti e organI linfatici Si dividono in Linfociti B Linfociti T Linfociti null (cellule natural Killer)

I linfociti B e T quiescenti sono piccoli, mobili, indistinguibili morfologicamente Quelle che non hanno incontrato l’Ag sono vergini (naive) e sono quiescenti nella fase Go del ciclo cellulare (diametro 6 mm, piccoli linfociti) Citoplasma scarso, cromatina molto addensata, pochi mitocondri RE e Golgi poco sviluppati I linfociti che incontrano l’Ag diventano attivati ed entrano nella fase G1, S, G2 e M del ciclo cellulare. Aumentano di volume (diametro 15 mm cellule blastiche o linfoblasti) e si sviluppano gli altri organuli cellulari I linfociti proliferano e differenziano in cellule effettrici e cellule della memoria

Linfociti B Maturano nel midollo osseo Esprimono sulla superficie un recettore (Ab) specifico per un antigene (Ab=antibody anticorpo) Dopo l’incontro con l’Ag maturano e si differenziano in Linfociti B della memoria e linfociti effettori (plasmacellule) Linfociti B della memoria esprimono lo stesso Ab delle cellule progenitrici Una plasmacellula sercerne più di 2.000 Ab al secondo Le plasmacellule muoiono in 1-2 settimane

Altre molecole di membrana dei linfociti B B220 marcatore della linea linfocitaria B e dei suoi precursori Molecole MHC di classe II permette al linfocita B di comportarsi come cellule presentante l’Ag CR1 e C2 recettori per alcuni prodotti del complemento Fcg/RII recettore per IgG B7-1 e B7-2 interagiscono con CD28 e CTLA-4, importanti molecole presenti sui linfociti T CD40 interagisce con il CD40-ligando sulla superficie del linfocita TH

Cellule T Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T (T cell receptor TCR) TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC, glicoproteine polimorfiche, presentate da altre cellule Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T: T helper (TH) Th1 e Th2 T citotossiche (Tc) o killer

VH CH1 VL CL CH2 CH3 fyn lck g e V V C C d Zap 70 fyn lck g e z V V C C CH1 CH2 CH3 CL VL VH d Iga/Igb Blk, Fyn or Lyn RECETTORE CELLULE B RECETTORE CELLULE T

Cellule null Non esprimono le molecole caratteristiche dei linfociti T e B Sono prive degli attributi fondamentali dell’immunità: la specificità e la memoria Comprendono i linfociti natural killer (NK) Sono di aspetto granulare e rappresentanto il 5-10% dei linfociti del sangue Svolgono un ruolo importante nei confronti delle cellule tumorali e infettate da virus

Cellule dendritiche Le cellule dendritiche sono globuli bianchi che attivano il sistema immunitario catturando gli antigeni ed esponendoli all’azione delle cellule 'killer', i linfociti T. Queste cellule risiedono principalmente a livello di quei tessuti che fungono da barriera con l'ambiente esterno e quindi sono più facilmente raggiungibili da agenti patogeni (mucosa nasale, polmonare, intestinale, gastrica e cute), dove ricoprono il ruolo di vere e proprie 'sentinelle'. Quando vengono a contatto con agenti estranei migrano a livello di quei tessuti che servono da basi al sistema immunitario (linfonodi), dove allertano le altre cellule di questa complicata macchina che ci difende dall'insorgenza di nuove malattie.

ANTIGENI

Antigeni sono sostanze in grado di indurre una risposta immunitaria Ci sono differenze fondamentali nel modo in cui i linfociti B e T riconoscno l’Ag Immunogenicità e antigenicità sono due propietà immunologiche correlate, ma distinte Un antigene è un immunogeno e l’antigenicità è la sua capacità di reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte immuni "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI ANTIGENI SONO IMMUNOGENI".

APTENE: molecola solitamente di piccole dimensioni che hanno la proprietà di essere antigeniche, ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta immunitaria (sono prive di immunogenicità). Può diventare anche immunogenica se si lega a una molecola carrier.Può reagire con i prodotti di una risposta immune specifica.

Proprietà dell’immunogeno Estraneità: tanto maggiore è la distanza filogenetica fra due specie, tanto maggiore è la lo diversità genetica Peso molecolare: macromolecole > 10 kDa Composizione ed eterogenità chimica: omopolimeri scarsa immunogencicità Copolimeri EKEKEKEKEK…..richiede un PM di 30.000 per essere immunogeno, se si aggiunge anche Y EKYEKYEKYEKY…….il PM si riduce a 20.000 Capacità di essere processato: le macromolecole devono essere processate dalle cellule che presentano l’Ag. Più alta è quasta capacità maggiore è l’immunogenicità

Ruolo del sistema biologico nell’immunogencità Lo sviluppo di una risposta immunitaria dipende da alcune caratteristiche del sistema biologico con cui l’agente entra in contatto: Genoma ospite Dose e via di somministrazione: gli immunogeni sperimentali sono somministrati per via parentale Associazione di altre sostanze (adiuvanti): sostanze che unite a un Ag e iniettate con esse, ne aumentano l’immunogenicità. Uno dei più usati è l’adiuvante di Freund che contienen l’Ag in una soluzione acquosa, olio minerale ed agente emulsionante (monooleato di mannite) che disperde l’olio in piccole gocce intorno all’Ag. Si ottine un lento rilascio dell’Ag dal sito di inoculazione

EPITOPO O DETERMINANTE ANTIGENICO: PARTE DI UN ANTIGENE CHE ENTRA IN CONTATTO CON IL SITO DI LEGAME DI UN ANTICORPO O COL RECETTORE PER L’Ag DELLE CELLULE T o B. (GLI EPITOPI SONO PRATICAMENTE LE PORZIONI PIÙ IMPORTANTI DELL’ANTIGENE, CAPACI DI EVOCARE LA RISPOSTA IMMUNITARIA).

Quando i farmaci diventano immunogeni I farmaci sono piccole molecole incapaci di scatenare la risposta immunitaria se non sono associate a una molecola più grande La penicillina in alcuni individui può reagire con alcune proteine dell’organismo per formare un derivato penicilloil-proteina (aptene-vettore), in cui il derivato penicillinico, il gruppo penicilloil, ha la funzione di epitopo aptenico Questo epitopo è riconosciuto dal sistema immunitario che produce Ab (IgE) contro di esso. Le IgE vengono trasportate in tutto l’organismo dove vengono riconosciute dai recettori per le IgE posti sui basofili (mast-cellule) e rimanere per molto tempo. Se a una persona che ha anticorpi IgE contro la penicillina viene somministrata penicillina, andrà incotro a reazione allergica 1-5% della popolazione ha questo problema

SISTEMA IMMUNITARIO ACQUISITO

Sistema immunitario specifico Origine Linfociti: Linfociti T Linfociti B

VH CH1 VL CL CH2 CH3 fyn lck g e V V C C d La selezione clonale dei linfociti B e linfociti T è alla base della risposta innata Sia i linfociti B che T esprimono recettori dotati di una singola specificità Linfociti B esprimono immunogobuline (Anticorpi, Ab) Linfociti T esprimono recettori Ciascun linfocita da origine a un unico tipo di molecola Ciascun linfocita, stimolato dal patogeno da origine a una popolazione di cellule che esprimono tutte immunoglobuline o recettori delle cellule T identici (SELEZIONE CLONALE) Zap 70 fyn lck g e z V V C C CH1 CH2 CH3 CL VL VH d Iga/Igb Blk, Fyn or Lyn

Esempio: SELEZIONE CLONALE nei linfociti B Ogni linfocita B esprime sulla membrana 150.000 Anticorpi (recettori) identici per lo stesso Ag

Gli strumenti del sistema immunitario acquisito Immunoglobuline o Anticorpi Recettore delle cellule T Complesso maggiore di istocompatibilità e proteine MHC su APC Cellule che presentano l’antigene (APC)

Immunoglobuline: struttuta e funzione

Antibody Molecule Structure Ag binding region Ag VH N terminal end CH1 VL h CL = Y Light Chain CHO CH2 globular domains disulfide bonds CH3 Heavy Chain C terminal end

2 catene leggere identiche (L, light, 220 aminoacidi) 2 catene pesanti identiche (H, heavy, 440 aminoacidi) A forma di Y rovesciata Ponti S-S fra le catene 2 siti di legame per Ag (bivalenti) Zona di riconoscimento per Ag o Fab (Fragment Antigen Binding) con sequenza di aminoacidi relativamente variabile Zona costante o Fc (Fragment cristallizzabile) con sequenza di aminoacidi relativamente costante REGIONI IPER VARIABILI La variabilità della sequenza di aminoacidi è confinata in 3 regioni ipervariabili (5-7 aminoacidi per L, 6-17 aminoacidi per H) Il sito antigenico è composto dalle regioni ipervariabili della catena L e dalle regione ipervariabili della catena H Alta costante di affinità Ig-Ag (104-1011 l/mole)

Papain Cleavage

Papain Cleavage 2 Fab Fc

Pepsin Cleavage

Pepsin Cleavage F(ab’)2 Enzymatic degradation of Fc fragment.

Funzione effettrice Legame a C4b C fissazione (legame a C1q ) Si lega a FcR (neutrofili; NK cells) Si lega a FcR (Mac, Mono)

Come agiscono gli anticorpi Gli Ab eliminano gli Ag e uccidono i patogeni utilizzando 3 funzioni effettrici principali: Opsonizzazione (fagocitosi dell’Ag da parte dei macrofagi e neutrofili) Attivazione del complemento (IgM e sottoclassi di IgG) Interazione con i recettori Fc delle cellule NK

Classi di anticorpi Esistono 2 tipi di catene leggere K (uomo 60%) l (uomo 40%) Esistono 5 classi di catene pesanti: m, g, a, d, e Ognuna di queste diverse catene pesanti è chiamata ISOTIPO Ogni Ab è formato da 2 catene pesanti e 2 catene leggere identiche H2L2, oppure è un multimero di questa struttura base a 4 catene (H2L2)n

5 Classi di anticorpi nell’uomo Classe catena sottoclassi catena formula pesante leggera molecolare IgG g g1g2g3g4 K, l g2K2, g2 l2 IgM m nessuna K, l (m2K2)n (m2l2)n n=1 o 5 IgA a a1, a2 K, l (a2K2)n (a2l2)n n=1,2,3,4 IgE e nessuna K, l (e2K2) (e2l2) IgD d nessuna K, l (d2K2) (d2l2)

Immunoglobuline: struttura IgG, IgD, IgE, and IgA IgA Antibodies belong to a family of large protein molecules known as immunoglobulins. Scientists have identified nine chemically distinct classes of human immunoglobulins, four kinds of IgG and two kinds of IgA, plus IgM, IgE, and IgD. Immunoglobulins G, D, and E are similar in appearance. IgG, the major immunoglobulin in the blood, is also able to enter tissue spaces; it works efficiently to coat microorganisms, speeding their destruction by other cells in the immune system. IgD is almost exclusively found inserted into the membrane of B cells, where it somehow regulates the cell’s activation. IgE is normally present in only trace amounts, but it is responsible for the symptoms of allergy. IgA--a doublet--guards the entrance to the body. It concentrates in body fluids such as tears, saliva, and secretions of the respiratory and gastrointestinal tracts. IgM usually combines in star-shaped clusters. It tends to remain in the bloodstream, where it is very effective in killing bacteria. IgM

Funzione degli anticorpi IgG: Coinvolte nella risposta umorale 70% delle Ig sieriche Azioni: Opsonizzazione Neutralizzazione di microbi e tossine Attivazione del complemento per via classica Attraversare la placenta IgM: Primi a comparire nel sangue in risposta ad antigeni Potere agglutinante a causa dei molteplici siti disponibili Attivatori del Complemento Non attraversano la placenta

Sintetizzate da linfociti B dei tessuti linfoidi associati alle mucose IgA: Ig dimeriche Sintetizzate da linfociti B dei tessuti linfoidi associati alle mucose Presenti nelle secrezioni, latte, saliva, lacrime, etc. Impediscono l’aderenza di microrganismi. Scarsa attività opsonizzante Attivazione del complemento per via alternativa IgE: Reazioni di ipersensibilità di Tipo I (asma, febbre da fieno) provocando il rilascio di citochine e mediatori infiammatori. Attivi nelle infezioni da parassiti favorendo l’attività citotossica degli eosinofili. IgD: Ig di membrana espresse sulla superficie dei linfociti. Ruolo non chiarito, ma sono importanti drante la differenziazione dei linfociti B.

Ruolo delle IgE nella secrezione di istamina Recettore Fc per IgE Ag IgE Vescicole di istamina mastocita Istamina Vasodilatazione, reazioni allergiche Rilascio di istamina

Il sistema del Complemento Sistema di Proteine attivate enzimaticamente dal legame di un anticorpo ad un antigene che portano alla formazione di un complesso terminale capace di attaccare e dissolvere la parete batterica o la membrana di cellule tissutali. Vie di Attivazione: Classica - In cui sono presenti tutti i componenti attivata dal complesso antigene-anticorpo Alternativa – Innescata da membrane microbiche e molecole non anticorpali. Assenza di alcuni componenti. Lectinica – Attivata da lectine plasmatiche che si legano ai microrganismi.

Produzione di componenti biologicamente attivi. Funzioni: Interazione con i recettori della superficie cellulare per indurre la fagocitosi Molecole recettrici su polimorfonucleati, macrofagi e frammento Fc degli anticorpi Produzione di componenti biologicamente attivi. Tramite proteolisi il complemento si attiva liberando un frammento b che prende parte ad ulteriori reazioni ed un frammento a che si comporta come mediatore flogistico. Danno della membrana tramite il complesso d’attacco

Complement C2 C3 C3a C5a C7 C1 C6 C8 C5b IgG C5b C4 Enzyme C3b C5 Antigen C9 The complement system consists of a series of about 25 proteins that work to “complement” the work of antibodies in destroying bacteria. Complement also helps rid the body of antigen-antibody complexes. Complement proteins are the culprits that cause blood vessels to become dilated and leaky, causing redness and swelling during an inflammatory response. Complement proteins circulate in the blood in an inactive form. The so-called “complement cascade” is set off when the first complement molecule, C1, encounters antibody bound to antigen in an antigen-antibody complex. Each of the complement proteins performs its specialized job, acting, in turn, on the molecule next in line. The end product is a cylinder that punctures the cell membrane and, by allowing fluids and molecules to flow in and out, dooms the target cell.

Complesso di attacco alla membrana C5b C5a C5 70-100 Å C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C7 C8 C6

Natura especifica Richiede regolazione per evitare danni ai tessuti sani Sistemi di regolazione attivi e passivi Passivi: estrema labilità di molti componenti che si inattivano subito Attivi: vari regolaotri che inattivano i prodotti del compelmento Deficit a carico del C3 sono clinicamente più importanti; aumentano la suscettibilità alle infezioni batteriche

La via lectinica è innescata dalla proteina legante il mannosio, che ha siti di legame per i carboidrati tipici della superficie batterica. Una volta legata al batterio scatena una serie di reazioni enzimatiche che attivano il COMPLEMENTO

Ogni famiglia genica contiene numerosi segmenti genici: Gli anticorpi vengono prodotti da tre distinte famiglie geniche localizzate su cromosomi diversi: per le catene leggere K per le catene leggere l per le catene pesanti Ogni famiglia genica contiene numerosi segmenti genici: Regione variabile V e J nella catena leggera Regione variabile V, D, J nella catena pesante Regione costante Segmenti genici separati codificanti parti diverse delle regioni variabili delle catene leggere e delle catene pesanti vengono unite mediante fenomeni di ricombinazione nel corso del differenziamento della cellule B

Sintesi delle catena leggera K nel topo:riarrangiamento V-J della Vn DNA della linea germinale Regioni di DNA da unire V= circa 300 J = 4 C V1 V2 V3 J3 J4 DNA della cellula B trascrizione RICOMBINAZIONE SOMATICA CATENA LEGGERA splicing C V3 J3 Sintesi delle catena leggera K nel topo:riarrangiamento V-J della catena leggera traduzione C V3 J3 NH2 COOH

Segmenti genici della catena pesante nel topo V1 V2 Vn D2 Dn J1 J4 Cm Cd Cg Ce Ca Esistono almeno 100-1000 segmenti genici V 12 segmenti D 4 segmenti J gruppo ordinato di segmenti C codificante una classe diversa di catene pesanti

I riarrangiamenti avvengono in ordine sequenziale: prima quelli della catena pesante poi quelli della catena leggera Sono finemente regolati, in modo tale che il DNA di un solo cromosoma parentale venga riarrangiato a formare un gene funzionale per la catena leggera o pesante. Questa esclusione allelica assicura che Ab maturo abbia la specificità antigenica singola

Diversificazione combinatoria Uno dei circa 300 V si può unire a uno dei 4 J 300 x 4 = 1200 diverse regioni V (catena leggera) Uno dei 100-1000 V si può unire a uno dei 20 D e dei 4 J: 1000 x 20 x 4 = 80.000 diverse regioni V Una ulteriore diversità deriva dal fatto che gli eventi di giunzione sono imprecisi. Si può avere perdita di basi e cambiamneto di Frame

Combinatoriale leggera-pesante 8262 x (200+120)= 2,64 x 106 Regione V, D, J nella catena Pesante e Leggera k e l Segmenti Genici catena pesante C.leggera l C.leggera k V 51 40 30 D 27 0 0 J 6 5 4 Possibili Combinazioni 51x27x6=8262 40x5=200 30x4=120 Associazione Combinatoriale leggera-pesante 8262 x (200+120)= 2,64 x 106

Una ulteriore diversità deriva dal fatto che gli eventi di giunzione DIVERSITA’ GIUNZIONALE Una ulteriore diversità deriva dal fatto che gli eventi di giunzione sono imprecisi. Si può avere perdita di basi e cambiamneto di Frame V GAG GAT CCT CCC ACA…. TAC CAC TGT GGT GGA CGT TA… J GAG GAT CCG GTG GAC GTT A… Cambia il Codice di lettura GAG GAT CCG TGG ACG TT A GAG GAT CCT GGA CGT TA….

Nucleotidi P: aggiunta di nucletidi ad opera degli enzimi di riparazione Nucelotidi N: aggiunta di di nucleotidi durante i processi di giunzione D-J e V-D-J mediante l’enzima terminal-trafesrasi Ipermutazione somatica: sostituzione di singoli nucleotidi nelle unità V-J e V-D-J

Switch isotipico tra i geni delle catene pesanti Il DNA della catena pesante può andare incontro a ulteriore riarrangiamneto in cui una unità V-D-J può combinarsi con uno dei segmenti C Esempio: V2-D4-J3 può combinarsi con Cd oppure con Cg... VH1 VHn n=250-1000 L1 Ln DH(1-12) JH Cm Cd Cg3 Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca

Linfociti T e recettore (TCR)

Cellule T Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T (T cell receptor TCR) TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC, glicoproteine polimorfiche Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T: T helper (TH) T citotossiche (Tc)

Meccanismi di ricombinazione simili a quelli delle Ig Il TCR riconosce solo Ag processati e associati a una molecola MHC espressa da una cellula APC o da una cellula bersaglio Il DNA del TCR è organizzato in domini variabili codificati da diverse regioni geniche e costanti (come Ig) Meccanismi di ricombinazione simili a quelli delle Ig Cellule T presentano altre molecole accessorie di interazione con le APC (cellule che presentano l’antigene) CD40, CD2, CD28, CTLA-4 Il TCR è associato al CD3, un complesso molecolare

Interazione APC e Linfocita T B7 (CD80/86) CTLA-4 Attivazione CD28 Attivazione B7 (CD80/86) TCR Riconoscimento MHC II APC CD4+ T Cell CD58 (LFA-3) CD2 Adesione Attivazione CD40 CD154 (CD40L)

2HN NH2 Ta Tb Vb Va Variabile Cb Ca costante membrana COOH Ogni catena è lunga 280 aa. Omologia strutturale e di Sequenza con gli Ab Circa 100 geni V 50 geni J Circa 30 geni V Circa 12 geni J Ta Tb membrana Variabile costante Recettore cellue T

Memoria immunologica Le risposte immunitarie acquisite danno luogo alla memoria immunologica di lunga durata e a una immunità protettiva La risposta immunitaria primaria è sviluppata da un numero limitato di linfociti L’intervallo necessario per la ooro espansione numerica fornisce al patogeno l’opportunità di avviare un processo infettivo fino alla comparsa della malattia Il cloni della risposta primaria comprendono anche le cellule della memoria di lunga durata, che rendono la risposta più veloce e più intensa a una successiva esposizione allo stesso patogeno L’intesità delle risposte secondarie può essere sufficiente a respingere la malattia

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC)

Tutte le specie di mammiferi possiedono un gruppo di geni strettamente associati, il complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC), i cui prodotti proteici sono coinvolti nel riconoscimento cellulare e nelle discriminazione self e non-self. Svolge un ruolo fondamentale nel determinare se un tessuto trapiantato può essere accettato come self (istocompatibile) o rigettato (istoincompatibile) MHC è fondamentale nello sviluppo delle risposte sia umorali che di tipo cellulare I linfociti T riconoscono gli antigeni solo se associati a molecole MHC

Viene denominato HLA (human leukocytes antigen nell’uomo) MHC è un gruppo di geni localizzato su un ampio tratto del Cromosoma 6 (uomo) e cromosoma 17 (topo) Viene denominato HLA (human leukocytes antigen nell’uomo) I geni sono localizzati in regioni che codificano 3 classi di proteine: geni MHC di classe I codificate nelle regioni A, B, C geni MHC di classe II codificati nelle regioni DP, DQ, DR geni MHC di classe III

MHC è uno dei complessi genetici più polimorfici dei Le molecole MHC espresse da un individuo non si modificano nel tempo e possono differire da quelle espresse da un altro individuo della stessa specie POLIMORFISMO MHC è uno dei complessi genetici più polimorfici dei vertebrati più evoluti e possiede un numero straordinariamente elevato di alleli diversi per ciascun locus Gli alleli differiscono del 5%-10% nella sequenza del DNA da un individuo all’altro

Proteine MHC sulle cellule che Presentano l’antigene

Antigen presenting cells (APC) Le molecole MHC di classe I e classe II legano il peptide derivante dal processamento dell’Ag Gli Ag di classe I si associano a molecole derivanti da antigeni endogeni Gli Ag di classe II legano molecole derivate da antigeni esogeni MHC di classe I sono su tutte le cellule (non specializzate) Fibroblasti, cellule gliali (cervello), cellule endoteliali, epiteliali, ecc. MHC di classe II solo su cellule specializzate: Linfociti B Cellule dendritiche Macrofagi

LE MOLECOLE DI CLASSE I e II appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline Entrambe presentano l’antigene ai linfociti T Le molecole di classe I sono espresse in tutte le cellule nucleate che presentano gli antigeni endogeni processati ai linfociti CD8+ Le molecole di classe II sono espresse solo in numero limitato di cellule presentanti l’antigene (macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B) che presentano gli Antigeni esogeni processati dai linfociti CD4+

Restrizione immunitaria per le molecole MHC: I linfociti T citotossici CD8 sono ristretti alla classe MHC I I linfociti TH CD4 alle molecole di classe MHC II A seconda della provenienza dell’antigene, intracellulare (endogeno) o extracellulare (esogeno), il sistema immunitario viene attivato in modo diverso Antigeni esogeni: ciclo endocitico Antigeni endogeni: ciclo citosolico

Ag esogeni complesso peptidi TAP RE Complesso proteasoma MHCI/peptide Trasportatore associato alla processazione dell’Ag ubiquitina7ATP Ag esogeni complesso peptidi TAP RE Complesso proteasoma MHCI/peptide Via citosoilica esopeptidasi Aminoacidi semplici Endocitosi/ fagocitosi Ag esogeni compartimenti peptidi complesso endocitari MHCII/peptide Via endocitica

MHC lega piccoli peptidi, 8-10 amminoacidi Ligandi Classe I circa 9 aa. Ligandi Class2 II tra 12 e 25 aa. Un core di 9 amminoacidi è fondamentale per il legame tra peptide/MHC.

Human Tissue Typing for Transplants HLA Chromosome 6 D B C A Leukocyte Although MHC proteins are required for T cell responses against foreign invaders, they can pose difficulty during transplantation. Every cell in the body is covered with MHC self-markers, and each person bears a slightly unique set. If a T lymphocyte recognizes a non-self MHC scaffold, it will rally immune cells to destroy the cell that bears it. For successful organ or blood stem cell transplantations, doctors must pair organ recipients with donors whose MHC sets match as closely as possible. Otherwise, the recipient’s T cells will likely attack the transplant, leading to graft rejection. To find good matches, tissue typing is usually done on white blood cells, or leukocytes. In this case, the MHC-self-markers are called human leukocyte antigens, or HLA. Each cell has a double set of six major HLA markers, HLA-A, B, and C, and three types of HLA-D. Since each of these antigens exists, in different individuals, in as many as 20 varieties, the number of possible HLA types is about 10,000. The genes that encode the HLA antigens are located on chromosome 6. MHC protein

Ogni cellula del corpo è coperta di markers MHC-self, e ogni persona porta un set unico di questi markers. Se un linfocita T riconosce un struttura MHC non-self essa reagisce rapidamente per distruggerla. Per un trapianto di successo di un organo o di cellule staminali è necessari paragonare il set MHC del donatore e del ricevente. Devono essere il più possibile simili. Per trovare un buon “match” è necessario fare la tipizzazione tissutale dei linfociti. In questo caso i marker MHC-self sono chiamati HLA (human leukocytes antigens). Ogni cellula ha un doppio set di sei principali markers HLA, HLA-A, B e C e tre tipi di HLA-D.

Tipizzazione dell’HLA Gruppo di Alleli polimorfici trasmessiinsieme è definito APLOTIPO

SCHEMA GENERICO Complesso APC/MHC-pep/CellulaT recettore Cellula T recettore Peptide estraneo Complesso peptide estraneo/recettore/ MHC MHC (I o II) Cellula che presenta Ag CD4/8 MHC Peptide estraneo

Come viene innescato l’intero sistema

Linfociti T helper: secernono citochine che favoriscono la risposta umorale e cellulo-mediata. Si attivano a contatto con uno specifico antigene presentato da una molecola MHC di classe II (sulla membrana di un macrofago o su un linfocita B). Allo stesso tempo si generano linfociti T di memoria a lunga vita. Le risposte combinate dei linfociti T helper, dei linfociti T citotossici e dei linfociti B controllano la specifica rimozione di antigeni dannosi e forniscono l’immunità permanente verso di essi. La risposta immunitaria cellulo-mediata si verifica quando i linfociti T citotossici riconoscono uno specifico antigene presentato da una molecola del complesso maggiore di istocompatibilità MHC di classe I sulla membrana di una cellula infettata da un virus o su una cellula tumorale. Si differenziano quindi in cellule (killer) assassine. I linfociti T citotossici rilasciano perforine ( formano dei pori nella membrana della cellula colpita) e frammentine (entrano nella cellula e determinano la sua morte, apoptosi). La risposta immunitaria umorale deriva dall’attivazione dei linfociti B. In seguito al contatto con specifici antigeni sulla membrana del batterio, i linfociti B proliferano e si differenziano in linfociti B di memoria a lunga vita e plasma-cellule a vita breve. Mentre i linfociti B di memoria sono responsabili dell’immunità permanente ad un antigene, le plasma-cellule secernono anticorpi che si uniscono ad un antigene bersaglio e quindi reclutano atri fattori di difesa (per esempio cellule fagocitarie) per distruggerlo.

Attivazione delle cellule T L’attivazione di una cellula T citotossica o helper a proliferare e differenziarsi in cellula effettrice avviene per interazione con la cellula che presenta l’antigene, la quale deve trasmette alcuni segnali: 1° segnale: peptide estraneo legato alla proteina MHC. 2° segnale: proteine stimolatrici, come le proteine B7 (CD80 e CD86) che sono riconosciute dal corecettore CD28 sulle superficie della cellula T. Se le cellule T helper ricevono entrambi i segnali, si attivano, proliferano e secernono una citochina, chiamata interluchina-2. 3° segnale: secrezione di interleuchine diverse Le cellule T helper assumono il comando della risposta immunitaria attivano tutte le altre cellule a proliferare

Attivazione di Cellule T da APC attivato IL-1 IL-6 IL-12 IL-12 Recettore CD4+ T cell CD28 “segnale 3” B7 “Segnale 2” CD4 Recettore Linf. T LPS TLR4 “Segnale 1” Signal 1: Specificità Signal 2: Attivazione Signal 3: Differenziamento Peptide MHC II Antigen Presenting Cell (APC)

Cellule TH1 e TH2 Esistono due tipi di cellule T helper: TH1 e TH2. Questa distinzione è fatta sulla base delle citochine che secernono: le cellule TH1 secernono l’interferone g (IFN-g) il fattore di necrosi tumorale (TNF-a) aiutano essenzialmente i macrofagi, le cellule T citotossiche e -in parte- le cellule B; le cellule TH2 secernono le interleuchine 4, 5, 10 e 13 (Il-4, Il-5, IL-10 e IL-13) stimolano le cellule B (solo quelle che presentano lo stesso antigene) a produrre anticorpi. La differenziazione delle cellule T in TH1 e TH2 influenza quindi il tipo di risposta immune che deve essere organizzata contro il patogeno. Una volta che TH1 o TH2 si sono sviluppate avviene una inibizione reciproca, cioè se si formano le TH1, la produzione di (IFN-g) inibisce lo sviluppo di TH2, mentre la produzione di IL-4 e IL-10 prodotte da TH2 inibisce lo sviluppo di TH1.

Attivazione da parte delle cellule Th1 Attivazione dei macrofagi. Le cellule TH1 utilizzano due segnali per attivare i macrofagi: 1) la IFN-g 2) il ligando della proteina CD40 si lega alla proteina CD40 presente sulla superficie del macrofago. A questo punto i macrofagi attivati possono uccidere i patogeni contenuti nel fagosoma attraverso processi idrolitici, la formazione di radicali e ossido nitrico. Attivazione delle cellule T citotossiche. Le cellule TH1 attivano le cellule T citotossiche negli organi linfoidi periferici stimolando le cellule dendritiche a produrre proteine costimolatrici. Inoltre, la secrezione di IFN-g aumenta l’efficienza con cui le cellule bersaglio processano gli antigeni virali per presentarli alle cellule T citotossiche. Attivazione delle cellule B. Le cellule TH1 possono aiutare le cellule B a proliferare e differenziarsi sia in cellule secernenti anticorpi che cellule memoria. Inoltre stimolano anche il cambiamento di classe degli anticorpi.

Meccanismo di attivazione da parte delle cellule Th2 Il primo segnale è rappresentato dall’antigene che si lega al recettore-anticorpo legato alla membrana della cellula B. Processi di fosforilazione Il secondo segnale è costituito dal ligando della proteina CD40, che è espressa sulla superficie delle celluleT attivate, ma non su quelle a riposo. L’interazione tra il ligando del CD40 e il CD40 è necessaria perché le cellule T attivino le cellule B a proliferare e a maturare in cellule della memoria e in cellule che secernono gli anticorpi. Nello stesso tempo viene prodotta interleuchina 4 (Il-4), che stimola la proliferazione e la maturazione delle cellule B

Attivazione dei macrofagi. IFN-g

I meccanismi con cui le cellule T citotossiche uccidono le cellule bersaglio infettate sono due: 1- rilascio di una proteina, la perforina, in grado di formare pori sulla membrana della cellula infettata. Questa proteina, dapprima conservata in vescicole secretorie, viene rilasciata per esocitosi locale nel punto di contatto con la cellula bersaglio. Da queste vescicole sono rilasciate anche alcune proteasi, in particolare la granzyme B, che attiva alcune caspasi, innescando il processo apoptotico della cellula 2- Una proteina trimerica sulla superficie delle cellula T citotossica , si lega e attiva la proteina Fas sulla superficie della cellula bersaglio. La coda citosolica della Fas contiene un dominio che, quando è attivato, si lega a una proteina adattatrice e recluta la procaspasi-8. La successiva attivazione della caspasi 8 da inizio alla cascata proteolitica che porta al processo apoptotico.

Schema della risposta immunitaria Ingesione patogeni (Macrofagi) Digestione Patogeni Frammenti di antigeni proteici del Patogeno vengolo legati al MHC aulla membrana dei Macrofagi I Macrofagi presentano l’antigene ai Linfociti T Cellule T con recettori per l’antigene vengono sensibilizzate Cellule T sensibilizzate si dividono Cellule T Suppressor Cellule T helper Cellule T citotossiche Stimolano le cellule T esprimenti lo stesso recettore Inibiscono le Cellule B con lo stesso recettore antigenico Distruggono l’antigene

Stimolano le cellule T esprimenti lo stesso recettore Cellule T helper Cellule T suppressor Stimolano le cellule T esprimenti lo stesso recettore Inibiscono le Cellule B aventi lo stesso recettore Termine della risposta immunitaria Divisione Cellule B Plasmacellule Cellule B di Memoria Cellule B producono Ab Anticorpi legano l’antigene Attivano il Complemento Aiutano I Fagociti a trovare gli antigeni Distruggono l’antigene