Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.

-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato: EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli GAATTC R = ceppo RY13 CTTAAG I = prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens GGATCC H = ceppo H CCTAGG I = prima endonucleasi isolata Simmetria binaria

Tipi di taglio -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’ -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE) Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

Quante volte taglia un enzima Probabilità di trovare un sito di restrizione: basi probabilità 4 (1/4)4 = 1/256 5 (1/4)5 = 1/1024 6 (1/4)6 = 1/4096 8 (1/4)8 = 1/65536

DNA ligasi

defosforilazione

Gel elettroforesi

Southern blot Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.

Chimica del DNA Soluzione viscosa a pH 7 Diminuzione viscosità a pH estremi o a T> 80°C Denaturazione ( aumento D.O) Rinaturazione (diminuzione D.O.) Formazione di ibridi anche tra catene di specie diverse I nucleotidi vanno incontro a trasformazioni chimiche (mutazioni)

DENATURAZIONE E RINATURAZIONE La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.

ANALISI FISICA Effetto ipercromico: Grado di denaturazione (%) 40 60 80 100 50 1.3 1.2 1.1 1.0 Temperatura (°C) Assorbanza a 260 nm Tm Curva di fusione Effetto ipercromico: Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA. Temperatura di melting (Tm): Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%. Maggiore è G+C, maggiore è Tm.

CINETICA di RINATURAZIONE Log Cot Rinaturazione (%) DNA a rinaturazione rapida 50 100 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Curva C0t lenta Effetto ipocromico: Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA. Parametri che influenzano la rinaturazione: 1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume 2) Tempo La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA

forma A forma B forma Z Senso elica destrorsa destrorsa sinistrorsa Diametro 26 A 20 A 12 A Coppie di basi per ogni giro di elica 11 10.5 12 Distanza tra basi 2.6 A 3.4 A 3.7 A Piegamento basi rispetto all’asse dell’elica 20° 6° 7° Conformazione dello zucchero C-3’ endo C-2’ endo C-2’ endo per pirimidine C-3’ endo per purine Legame glucosidico anti anti anti per pirimidine sin per purine

Cot Fig. 13 Curva di Cot % ss DNA rimanente

SONDE E MARCATURA La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.

Metodi di marcatura Nick transaltion Random priming Marcatura terminale

5’P -3’OH 3’OH -5P’ nick con un -OH disponibile L’attività 3’5’ esonucleasica rimuove il nucleotide L’attività 5’3’ polimerasica sostituisce il nucleotide L’attività 5’3’ esonucleasica sposta il nick verso il 3’

Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali -3’OH 5’P 3’OH -5P’ Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali 3’P 5’OH Enzima Klenow + dNTP*

Metodo dell’innesco casuale Spostamento dell’incisione MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale NICK TRANSLATION Spostamento dell’incisione -3’ 3’- -5’ 5’- DNA denaturazione aggiunta di inneschi esanucleotidici 3’-GCATGC-5’ 5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’ 3’-TAGCAG-5’ ibridizzazazione Frammento di Klenow, dNTP dATP 32P-dCTP dTTP dGTP Sintesi DNA  DNA sonda marcato riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del nucleotide successivo -3’ 3’- -5’ 5’- DNA G C G C A A G C G C G T T C G G C A A G G C C A A G G C G A A G G C G C A G 32P-dCTP dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’ taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide mediante la DNA polimerasi I  Pol I 3’- -5’

Trattamento con fosfatasi 3’OH -5P’ 5’P -3’OH Trattamento con fosfatasi -5’OH 5’OH Polinucleotide chinasi+ [32P]dATP

I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente: -marcatura isotopica diretta (incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa l); -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico). I sistemi più usati sono: -Il sistema biotina-streptavidina -La digossigenina

Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina HN O N dUTP Uracile Desossiribosio Trifosfato S NH Biotina C U C G A G A U G U C A U G A G C T C T A C A G T A B DNA sonda DNA target A U G U C T A C A G E A F Ibridazione del DNA sonda col DNA bersaglio dei cromosomi (A) Avidina-enzima (B) Avidina-fluoroforo PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE: Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina E = molecole reporter fosfatasi alcalina o b-galattossidasi F = molecole reporter

Ibridazione L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari. L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA. L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari. Sono molto importanti le condizioni sperimentali.

Condizioni stringenti Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni sperimentali che permettono la migliore ibridazione. Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): maggiore Temperatura minore concentrazione salina presenza di denaturanti chimici Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): minore Temperatura maggiore concentrazione salina assenza di denaturanti chimici

Mappe di restrizione in diagnostica

...MAPPATURA di RESTRIZIONE 6 2 1 A B TRATTAMENTO DIMENSIONE dei FRAMMENTI (Kb) INTERPRETAZIONE Nessuna digestione Enzima A Enzima B Enzima A+ B 9 7 3 4 2 + 7 3 + 6 2 + 3 + 4 1 + 2 + 6

ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac Sequenziamento con isotopi radioattivi a = adenina c = citosina g = guanina t = timina g t a c g t a c g t a c g t a c MICROSATELLITE ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac dinucleotide :(ac)15

Polymerase Chain Reaction 1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Peli Seme DNA Doppia Elica 2) PCR Polymerase Chain Reaction Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo 3 paia di cromosomi omologhi 3) ELETTROFORESI

di un campione con 12 microsatelliti Immagine Computerizzata Sequenziatore Automatico Elettroferogramma di un campione con 12 microsatelliti Immagine Computerizzata dell’ elettroforesi GENOTIPO: 263/263 PADRE MADRE GENOTIPO: 263/277 DIAGNOSI POSITIVA FIGLIO GENOTIPO: 263/263 Profilo genetico di un campione FIGLIO GENOTIPO: 263/277

PADRE PADRE MADRE MADRE FIGLIO FIGLIO FIGLIO FIGLIO FIGLIO GENOTIPO: 128/140 PADRE GENOTIPO: 263/263 128 140 263 GENOTIPO: 128/146 GENOTIPO: 263/277 MADRE MADRE 128 146 263 277 FIGLIO GENOTIPO: 128/128 GENOTIPO: 263/263 128 FIGLIO 263 FIGLIO GENOTIPO: 124/128 124 GENOTIPO: 263/277 128 FIGLIO FIGLIO 263 277 GENOTIPO: 128/128 128 DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA