L'EREDITARIETA’2 Lezione 11 By NA

Ancora complicazioni: Insorgenza tardiva il fenotipo puo’ comparire in eta’ avanzata il fenotipo non e’ congenito pur essendo ereditario CONGENITO : presente alla nascita dal punto di vista genetico raramente questi fenotipi sono dovuti a nuove mutazioni a livello di popolazione l’allele mutato puo’ essere frequente purche’ l’ insorgenza si verifichi dopo l’inizio dell’eta’ riproduttiva e non limiti la fitness FITNESS: IDONEITA’ BIOLOGICA, piu’ semplicemente : numero di figli By NA

Insorgenza tardiva By NA

espansione di triplette: tipo di mutazione individuata nel 1990 Anticipazione alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante diventano piu’ gravi nelle generazioni successive perche? espansione di triplette: tipo di mutazione individuata nel 1990 Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere il fenotipo patologico. Il rischio non e’ piu’ quantizzabile in termini probabilistici By NA

Schema di mutazioni dinamiche CGG 1000 280 GAA 900 200 CTG 3000 Mutazione completa, range di mutazione 200 60 CGG GAA CTG Premutazione 22 50 Normale 52 6 CGG GAA CTG 37 3 7 5’UTR esone introne esone introne esone 3’UTR X-fragile Distrofia miotonica Atassia di Friedrich Mutazione completa, range di mutazione 121 36 CAG 75 49 CGG Premutazione 35 25 CAG CGG CAG Normale 10 CGG 7 Esone ORF Corea di Huntington Atassia spinocerebellare 1 By NA

Mutazioni dinamiche – effetto fondatore Dal momento che le ripetizioni del range di normalità NON aumentano di numero dopo replicazione, da dove sono nati gli alleli instabili? EFFETTO FONDATORE: Eccezionalmente, in uno o pochi individui, si sono verificati degli errori nella trascrizione, producendo degli alleli con un numero di ripetizioni aumentato, che sono stati ereditati nelle successive generazioni, producendo un pool di alleli instabili presenti oggi nella popolazione Per molte delle mutazioni dinamiche l’effetto fondatore è stato dimostrato Questo effetto fondatore si riconosce anche nell’assenza o maggior frequenza di alcune di queste patologie in certe aree geografiche By NA

Mutazioni dinamiche meccanismo dell’instabilità Perché oltre una certa lunghezza compare il fenomeno dell’instabilità? La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la formazione di strutture alternative, assenti quando il numero di ripetizioni è nel range di normalità Queste strutture causano problemi sia nei processi di trascrizione (slippage della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA La conseguenza ultima è la tendenza all’incremento numerico delle ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!) Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni, ma per la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite By NA

Mutazioni dinamiche strutture alternative del DNA By NA

Mutazioni dinamiche espansioni e contrazioni It is generally thought that the unusual structural features of expandable repeats predispose them to instability. Indeed, repeats that are not structure-prone are considerably more stable genetically18,25,28. Furthermore, the stabilizing effect of interruptions within the repetitive run in long-normal alleles is probably a result of their destabilizing effect on these unusual DNA structures18,29. This has led to the idea that a misalignment between the two repetitive strands during DNA replication, further stabilized by unusual conformations of repetitive slip-outs (Fig. 3a), is the basis of repeat instability. After the next round of replication, either expansions or contractions occur, depending on the origin of the slipped-out strand30. These slipped-stranded intermediates can be formed in the course of genetic processes that involve the separation of DNA strands: for example, DNA replication, repair and recombination. At present, each of these processes has been implicated in repeat expansions in one or another experimental system. It should be noted, however, that these unusual structures would be only transient intermediates during those processes, making their direct detection challenging. an unusual secondary structure. Studies of DNA synthesis of expandable repeats in vitro support these ideas. Unusual DNA structures that are formed by expandable repeats during DNA synthesis in vitro stall various DNA polymerases20,24. Occasion ally, this stalling results in the misalignment of repetitive DNA strands, causing repeat expansions or contractions31. By NA

Mutazioni dinamiche principi generali delle mutazioni dinamiche INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di espansioni di grandezze differenti all’interno dello stesso tessuto e tra tessuti differenti. Produce dunque un mosaicismo tissutale INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle generazioni successive di una espansione di diversa ampiezza. E’ alla base del meccanismo dell’anticipazione TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune patologie, si possono avere espansioni o contrazioni del numero di ripetizioni a seconda che l’allele mutato sia trasmesso dal padre o dalla madre By NA

Mutazioni dinamiche Localizzazione delle espansioni Perché un aumento nel numero di sequenze ripetute causa una patologia? Esistono differenti meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie By NA

Mutazioni dinamiche Classificazione molecolare Espansioni in porzioni codificanti (esoniche) del gene: Poliglutamine (Corea di Huntington, malattia di Kennedy, SCAs) Polialanine (Oloprosencefalia, sinpolidattilia, hand-foot-genital syndrome) Espansioni in porzioni non codificanti del gene: Promotore (Epilessia progressiva mioclonica) 5’-UTR (Sindrome dell’X-fragile, SCA12) Introne (Atassia di Friedrich, Distrofia miotonica di tipo 2) 3’-UTR (Distrofia miotonica di tipo 1, SCA8) By NA

Mutazioni dinamiche Sindrome dell’X fragile By NA

La mutazione è dinamica Paradosso di Sherman 1985 Sherman paradox: solo l’80% dei maschi che ricevono l’allele sono affetti Le figlie di portatori dell’X-fragile sono più a rischio di avere figli con ritardo mentale rispetto alle proprie nonne (effetto di posizione nell’albero genealogico) La malattia non appare però completamente come dominante o recessiva, esistendo maschi sani con il sito fragile e femmine affette con un unico sito fragile ...... the first mutation caused a “premutation” state that produced no clinical symptoms, and that a second mutation was required to convert the premutation to a “full mutation” form that was associated with the characteristic symptoms Di qui l’ipotesi che qualcosa nel gene sia cambiato durante le generazioni. La mutazione è dinamica By NA

Mutazioni dinamiche – Sindrome dell’X fragile Come si spiega il paradosso di Sherman? La sindrome dell’X-fragile è stata la prima patologia da espansione di triplette riconosciuta (1991). Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3 La tripletta responsabile è CGG, situata nella porzione 5’-UTR L’espansione di questa tripletta è causa del 99% dei casi di FRAXA Valori normali: < 44 repeats Gray zone: 45-54 repeats Premutazione : 55-200 repeats Mutazione: > 200 repeats By NA

Mutazioni dinamiche – Sindrome dell’X fragile Soluzione del paradosso di Sherman: Nel passaggio da una generazione all’altra, soprattutto per trasmissione materna, il numero di triplette tende ad aumentare > normalmente, i maschi figli di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri Oltre le 200 ripetizioni: affetti Inferiore a 200 ripetizioni : clinicamente sani Se l’aumento resta nell’ambito della premutazione, i maschi che ricevono l’allele premutato lo trasmetteranno mediamente invariato alle figlie Le loro figlie avranno quindi un numero maggiore di ripetizioni rispetto alle nonne >aumentato rischio di salto oltre le 200 ripetizioni = aumentato rischio di figli con ritardo mentale rispetto alle nonne (effetto di posizione nell’albero genealogico) Oggi possiamo quantificare meglio il rischio di avere un figlio con ritardo mentale: Triplette inferiori a 55: rischio pari a 0 Triplette superiori a 100: rischio pari al 100% Valori intermedi: il rischio cresce esponenzialmente By NA

Mutazioni dinamiche – Sindrome dell’X fragile perche’ Come nella distrofia miotonica, l’espansione è localizzata in una porzione del gene non tradotta Diversamente da questa e’ una patologia da silenziamento genico Il gene e’ composto di 17 esoni ed e’ lungo 38 Kb.All’interno del primo esone al 5’UTR e’ presente una serie di CGG.Nella popolazione questa regione e’ polimorfica: varia da 7 a 52 ripetizioni: l’allele piu’ comune e’ quello di 30 (effetto fondatore). Quando il numero delle triplette supera 230 l’intera regione viene ipermetilata aggiungendo un gruppo metilico a C su entrambe le eliche il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente e la cromatina non riesce a condensare correttamente By NA

Mutazioni dinamiche – Sindrome dell’X fragile riassumendo La tripletta CGG si trova vicina al promotore del gene FMR1 in una zona ricca di CpG islands Un’espansione oltre i 200 repeats causa il richiamo di specifiche proteine che metilano le citosine del promotore del gene FMR1> MODIFICA EPIGENETICA La proteina FMRP è importante nello sviluppo neuronale e dei dendriti. Se il gene è silenziato > APLOINSUFFICIENZA Nei maschi, non si avrà alcun prodotto proteico (emizigoti) > affetti Nelle femmine, il prodotto presente dipende da quale cromosoma X è inattivato > affette se è maggiormente inattivo il cromosoma X normale, altrimenti sane (mosaicismo di metilazione) Ecco perché la frequenza delle femmine affette è minore By NA

Mutazioni dinamiche – Sindrome dell’X fragile riassumendo Ridefininizione di mutazione patologica: è definita come full mutation, corrisponde all’allele con oltre 200 triplette metilate Casi particolari (rari): Mosaicismo di lunghezza (normale/premutato; premutato/full mutato; normale/mutato) > fenotipo variabile Mosaicismo di metilazione (alleli con > 200 triplette metilati e non metilati) >fenotipo variabile 1% dei pazienti non presenta espansione di triplette : mutazioni puntiformi, delezione del gene Perché i maschi affetti non hanno figlie affette? I maschi con full mutation hanno solo premutazioni negli spermatozoi per la selezione degli spermatozoi durante lo sviluppo embrionale Di conseguenza, le figlie di maschi affetti saranno solo premutate e mai full mutate By NA

Mutazioni dinamiche – FMR1 related disorders Il 20% delle donne con premutazione presenta Premature Ovarian Failure (POF, esaurimento follicolare precoce) Circa il 20% degli uomini con premutazione presenta Fragile X ataxia/Tremor Syndrome (FXTAS), mentre è rarissima tra le donne Il gene FMR1 presenta quindi ETEROGENEITÀ ALLELICA NON sono patologie da aploinsufficienza : sono probabilmente patologie RNA-mediate:Gli alleli premutati non solo non sono silenziati, ma presentano anche un’aumentata trascrizione, per compensare il difetto di traduzione degli alleli espansi  accumulo di RNA By NA

Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington – meccanismi 1 Meccanismo patogenetico principale: tossicità da poliglutamine L’eccesso di glutamine nella sequenza aminoacidica impedisce il giusto ripiegamento (folding) della proteina stessa La proteina viene degradata ma i frammenti con le poliglutamine si aggregano Si formano accumuli all’interno dei nuclei dei neuroni con guadagno di funzione ed effetto citotossico  apoptosi e degenerazione neuronale Accanto a questo, ci sono altri meccanismi che contribuiscono a determinare il fenotipo (danno mitocondriale, alterazione della trascrizione di altri geni, alterazione del trasporto assonale) By NA

Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington – meccanismi 2 By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 – classificazione molecolare Gene responsabile: l’espansione riguarda la tripletta da CTG e si trova nella regione 3’UTR del gene DMPK che mappa sul cromosoma 19q13.3 Classificazione molecolare: 5-36 repeats: alleli normali 50-150 repeats: classe E1 150-1000 repeats: classe E2 1000 - >4000 repeats: classe E3 La forma congenita si manifesta in genere per espansioni di classe E3, trasmesse per via materna. Le espansioni trasmesse dal padre tendono ad essere più stabili (presenza sia di espansioni, sia assenza di variazione, sia rare contrazioni ) By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 - pedigree By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2 Miopatia miotonica prossimale (PROMM), simile e spesso indistinguibile a livello clinico dalla DM1 La sua frequenza non è chiara (1/50.000 circa) Le differenze maggiori con la DM1 riguardano Presenza di una clinica globalmente più lieve Possibile presenza di crampi e algie, mai presenti nella DM1 Colpisce prima i muscoli prossimali Non è mai presente una forma congenita con ritardo mentale By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2 La patologia è determinata da un’espansione di un tetranucleotide CCTG, presente nel primo introne del gene ZNF9, che mappa in posizione 3q21.3 Alleli normali: 11-26 repeats Alleli mutati: 75-11.000 repeats (media: 5.000 repeats) Nonostante il grandissimo numero di ripetizioni, non è possibile effettuare una correlazione genotipo-fenotipo La penetranza è completa e l’espressività è variabile DM1 e DM2 sono un esempio di ETEROGENEITÀ GENETICA, cioè mutazioni in geni differenti possono produrre lo stesso fenotipo Entrambe le patologie sono dotate di grandissimo mosaicismo somatico By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica – Patologia ad RNA Perché una mutazione in una regione non codificante provoca una patologia? Patologia dell’RNA By NA

Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica – Patogenesi Il gene DMPK è trascritto in mRNA che deve essere traslocato dal nucleo al citoplasma per essere processato Se è presente l’espansione, questa sarà trascritta in RNA (CUG). In seguito allo splicing dell’mRNA, il messaggero contenente la ripetizione CUG forma degli aggregati resistenti alla distruzione che rimangono intrappolati nel nucleo Questi aggregati interferiscono con altre proteine nucleari >guadagno di funzione In particolare, gli aggregati (“foci”) di RNA sequestrano una classe di proteine (MBNL1) e “spiazzano” una seconda famiglia di proteine (CELF). Questi due tipi di proteine sono necessari per un corretto assemblaggio dello spliceosoma L’effetto finale è l’alterazione dello splicing di altri geni, con conseguente alterazione funzionale di diversi pathways (effetto in trans) By NA

Forma di retinite pigmentosa che si manifesta Eredità digenica La malattia è dovuta all’effetto additivo di mutazioni ETEROZIGOTI in loci diversi Forma di retinite pigmentosa che si manifesta in individui DOPPI ETEROZIGOTI per i geni ROM1 e per la periferina (RDS) che codificano per i fotorecettori. Le mutazioni in eterozigosi separatamente non causano alcun fenotipo patologico By NA

Eredità digenica pedigree AFFETTO NON AFFETTO ROM1+/- RDS+/- ROM1+/+ RDS+/+ ROM1+/+ RDS+/+ ROM1+/- RDS+/+ ROM1+/+ RDS+/- ROM1+/- RDS+/- By NA

Eredità triallelica X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X ……………… Sindrome di Bardet –Biedl (BBS): sindrome dismorfica caratterizzata da obesità, polidattilia, patologia renale, deficit cognitivo Carattere autosomico recessivo, ma la condizione che si riscontra è quella di due mutazioni in un locus ed eterozigote in un altro locus associato X X X X X X X X BBS2 BBS4 BBS6 X X X X X X X X X X X Mutazione X X X ……………… AFFETTI NON AFFETTI By NA

Eredità triallelica pedigree BBS6 wt/A242S BSS2 wt/wt BBS6 wt/wt BSS2 wt/Y24X BSS2 Y24X/Y24X BBS6 wt/wt BSS2 wt/Y24X BBS6 wt/147X BSS2 wt/Q59X BBS6 wt/wt BSS2 wt/wt BBS6 wt/147X BSS2 Y24X/Q59X BBS6 wt/wt BSS2 Y24X/Q59X AFFETTO NON AFFETTO By NA

MECCANISMO BI/TRIALLELICA D x B D C A B B C A B A B B x A Funzione A legame meno stabile x B x assenza del fenotipo A B x B x D x x D comparsa del fenotipo C C D A A B x x A By NA