La trascrizione e i tipi di molecole di RNA Benjamin A. PIERCE Genetica Prima edizione La trascrizione e i tipi di molecole di RNA Capitolo 13: La trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

A gene is not directly translated into protein It is first expressed into mRNA Then translated into protein from the RNA intermediate Transcription into mRNA Translation of mRNA into protein Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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Upstream Regions Proximal Promoter element TATA box Exon Enhancer or UAS Intron a) Mammalian gene b) S. cerevisiae gene -200 -30 -10 to –50 kb -100 +10 to +50 kb -500 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

Initiation of Transcription TATA GENE 1. Inactive H E F RNA pol 3. Recruitment Phase B TATA TF11D B GENE A 2. Recruitment Phase A TATA TF11D B GENE A TF11D = (TAFs + TBP) 4. Transcription Starts!!! TATA TF11D RNA pol GENE A H E B F ? Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

Transcription Factors, TF Required but not a part of RNA pol complex Role in Gene Regulation Binding Interaction Initiation Enhancing Silencing Several different structural classes DNA-binding domain + Interactive domain Position and Combination – Important! TATA TF11D B E H RNA pol F A ? GENE Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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mRNA Synthesized by a DNA template by the same concept of complementarity Single stranded nucleic acid Identical to DNA apart the replacement of T with U Includes additional sequences on either end: 5’ nontranslated region the leader 3’ nontranslationl region the trailer Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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RNA polimerasi batterica RNA polimerasi eucariotiche RNApol II pre-mRNA, snoRNA, alcuni snRNA RNApol I rRNA RNApolIII tRNA, rRNA piccoli, alcuni rsnNA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

1. INIZIO della TRASCRIZIONE Riconoscimento del promotore PROMOTORE BATTERICO Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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1. INIZIO della TRASCRIZIONE Riconoscimento del promotore Seq.-35 e –10 (seq. AT –40/-60 con cui sub.alpha prende contatto) 2. Formazione della bolla di trascrizione 3. Creazione dei primi legami tra rNTP 4. Avanzamento della RNAPol a partire dal promotore 2. ALLUNGAMENTO Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

Terminatore a monte del sito di terminazione rallenta RNA Pol Rho-dipendente Rho-indipendente (seq.ripetute invertite) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

Terminatore Rho-dipendente seq.DNA che producono una pausa nella trascrizione Seq.DNA che codifica per RNA a monte del terminatore privo di struttura secondaria. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Rimodellamento cromatina Inizio della trascrizione (promotori ed enhancer) Reclutamento TF e/o attivatori trascrizionali e in seguito RNA Pol Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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L’ RNA Polimerasi II Catalizza la trascrizione di tutti i geni codificanti proteine (mRNAs), piu’ 4 snRNAs che partecipano allo splicing E’ formata da 2 subunita’ grandi (Large) L (128-150 kDa) e L’ (160-220 kDa), e da 12-15 subunita’ piu’ piccole, alcune specifiche ed altre in comune con l’ RNA Pol I e/o III L’estremita’ carbossi-terminale della subunita’ piu’ grande, L’, contiene una sequenza di 7 aa (il dominio carbossi-terminale o CTD) che e’ ripetuto molte volte (26x in lievito, 52x in mammiferi) Il CTD (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) e’ essenziale per la vitalita’ di un’organismo, e viene fosforilato durante la trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

L’inizio della trascrizione da parte dell’RNA Pol II richiede multipli fattori Fattori di trascrizione generali (GTF) insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, sufficiente alla trascrizione in vitro TBP (che con i fattori associati a TBP (TAF) forma -> TFIID) TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH Co-attivatori, che sono richiesti per la trascrizione in presenza di cromatina (trascrizione attivata) TAFs Acetilasi di istoni (HATs) Proteine che rimodellano la cromatina (SWI/SNF) Fattori associati all’RNA polimerasi (il Mediatore) Fattori di trascrizione specifici, richiesti per la trascrizione attivata: servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer Multipli fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti e’ controllata da numerosi elementi TATA Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II PROMOTORE PROSSIMALE CORE ~ -200 ~ -50 ENHANCER (~ 100 bp) LA CROMATINA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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TFIID TFIID e’ il GTF piu’grande, con una massa di circa 750 kDa Include una singola proteina di 38 kDa che lega la TATA box (TBP) e 11 fattori associati a TBP (TAFs) I TAF sono considerati co-attivatori (cioe’ non sono necessari per la trascrizione basale in vitro) TBP e’ la prima proteina che contatta il core promoter La regione C-terminale e’ altamente conservata (80% di identita’ tra lievito e uomo) TBP e’ un monomero che si ripiega a “sella di cavallo”, le cui 2 meta’ contattano il DNA lungo il solco minore causando una considerevole distorsione (bending) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

The conserved C-terminal domain of TBP binds to TATA-box DNA TBP is a subunit of TFIID Lodish Figure 10-51 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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2. RNA Pol III: sequenza di terminazione poli-U in RNA 1. RNA Pol I: fattore di terminazione si lega a DNA posta a valle del sito di terminazione 2. RNA Pol III: sequenza di terminazione poli-U in RNA 3. RNA Pol II: terminazione in corrispondenza di siti localizzati in regione molto estesa o terminazione oltre regione che codifica mRNA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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RNA polcistronici RNA monocistronici Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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CPSF= fattore per la specificità del taglio e della poliadenilazione CstF= fattore di stimolazione del taglio PAP= poli-A-polimerasi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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18-38nt Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti NUCLEO Genoma Meccanismi epigenetici: controllo a lungo e corto raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi responsivi di geni inducibili Trascritto primario (precursore) controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico mRNA controllo del trasporto CITOPLASMA mRNA controllo traduzionale controllo della stabilità traduzione degradazione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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t-RNA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

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Unico gene per rRNA 28S, 18S e 5,8S + gene per 5S Nei batteri Nei mammiferi Unico gene per rRNA 28S, 18S e 5,8S + gene per 5S Nei batteri Unico gene per rRNA 23S, 16S, 5S Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005