DIAGNOSI MICROBIOLOGICA L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Diagnosi microbiologica Il ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell'effettuare una diagnosi presuntiva Tutti i laboratori debbono essere in grado di sospettare la presenza di B. anthracis Nel sospetto il campione e/o le colture devono essere inviate ad un laboratorio, che possegga aree di lavoro corrispondenti al terzo livello di contenimento (P3), per la diagnosi definitiva. 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

B.anthracis è aerobio e anaerobio facoltativo immobile, sporigeno e, se ceppo virulento, capsulato non-emolitico su agar sangue di montone sensibile alla penicillina (salvo rarissimi ceppi, più spesso modificati) può presentarsi in due diverse forme: in forma vegetativa (1-1,5 x 3-8 m) in forma di spora (1 m). 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

B.anthracis: forma vegetativa la forma vegetativa (fase di attiva moltiplicazione) è quella che si riscontra nelle lesioni cliniche, nei relativi campioni biologici e di conseguenza nelle colture microbiologiche solo la forma vegetativa è in grado di produrre le tossine (antigene protettivo, fattore letale, fattore edemigeno) e la capsula , due dei fattori di virulenza tale forma vegetativa è facilmente distrutta dai disinfettanti comunemente utilizzati in ospedale, in particolare da quelli a base di cloro 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

B.anthracis: spore la forma di spora (fase di quiescenza) è quella che il microorganismo acquista in situazione di svantaggio e gli consente la sopravvivenza (in presenza di ossigeno atmosferico, nella terra e nel suolo, in acqua, polveri, pellami, ….) solo nel momento in cui si ritrova in un ambiente favorevole (inoculazione di spore attraverso lesioni cutanee, ingestione con acqua o alimenti, inalazione di un’elevata quantità di spore) riprende la capacità di moltiplicarsi e di dare danno le spore sono particolarmente resistenti nell’ambiente (sopravvivono anni) e non sono distrutte dai comuni disinfettanti 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Biosicurezza (1) B. anthracis non è contagioso da persona a persona L'infezione cutanea avviene solo attraverso soluzioni di continuo della cute e la forma da inalazione necessita di una elevata carica di spore, per cui il rischio di trasmissione in laboratorio è praticamente nullo Per i campioni potenzialmente infetti, adottare misure almeno del 2° livello di contenimento (cappa a flusso di classe 2 con filtri HEPA, indumenti di protezioni personale -camici monouso, guanti di lattice, mascherine, occhiali o schermi di protezione-) 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Biosicurezza (2) Le procedure devono essere eseguite da microbiologi o tecnici di microbiologia esperti Nel caso si giunga ad una identificazione presuntiva della presenza di B.anthracis, è sconsigliato allestire ulteriori procedure identificative. Il campione e/o la coltura devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la diagnosi definitiva. 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Decontaminazione Le superfici che possono essere state a contatto con materiali infetti devono essere decontaminate con prodotti a base di cloro in concentrazione di: 5.000 ppm (es. ipoclorito di sodio 5,25% -la comune candeggina- diluito 1:10) * 10.000 ppm (come sopra, diluendo 1:5) ** Gli altri materiali devono essere autoclavati seguendo le procedure in vigore nel laboratorio per i materiali infetti il CDC consiglia l’uso di diossido di cloro (gas) per il trattamento di ambienti contaminati da spore CDC, Guidelines for State Health Dpt (14.10.01) PHLS Provisional guidelines for action in the event of a deliberate release (11.10.01) 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Esame diretto dei campioni clinici Allestire due vetrini con uno striscio del materiale in esame: fissarli per 1 minuto con etanolo assoluto oppure 10 min con metanolo Colorare un vetrino con il Gram e uno con il Giemsa e osservarli al microsopio in immersione La presenza al Gram di grossi bacilli Gram-positivi (1-1.5 X 2-8 mm), con estremità squadrate e in corte catene di 2-4 cellule suggerisce la presenza di B. anthracis La colorazione di Giemsa può mettere in evidenza la presenza di capsula 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Gram di B. anthracis da sangue di scimmia (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Gram di B. anthracis da agar sangue (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Gram di B. anthracis con spore (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Esame colturale (1) Tampone nasale semina diretta su piastre di AS utile anche semina dopo trattamento termico o con alcool per eliminare la flora commensale stemperare il tampone in 1 ml circa di diluente (soluzione fisiologica o brodo) e sottoporre la sospensione a shock termico (bagnomaria a 65°C per 10 min.), oppure a shock etanolico (aggiungere pari volume di alcool etilico assoluto per 30 min.) dopo trattamento possono essere seminate, per inondazione, una o più piastre di AS con 0,1 ml della sospensione. 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Esame colturale (2) Altri campioni B.anthracis cresce rapidamente sui comuni terreni colturali, ma non su MacConkey allestire una coltura su Agar Sangue di montone (AS): su questo terreno è possibile evidenziare alcune caratteristiche distintive di B.anthracis allestire in contemporanea colture su altri tipi di terreni, secondo le procedure in uso nel laboratorio per i diversi tipi di campioni clinici incubare a 35°-37° C in un termostato ad aria per 18-24 ore 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Caratteristiche colturali (1) Aspetto delle colonie (su AS dopo 15-24 ore a 35-37°C) colonie di 2-5 mm, biancastre, a vetro smerigliato, rotonde o irregolari, piane o leggermente convesse, con margini frastagliati e proiezioni a forma di virgola che protrudono dal bordo della colonia (aspetto a “caput Medusae”) non emolitiche, a differenza di quelle di altre specie, quali B. cereus e B. thuringiensis, che producono su AS beta emolisi (emolisi completa) con consistenza notevole, appiccicose e filanti, quando raccolte con un'ansa 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Caratteristiche colturali (2) Aspetto delle colonie (su Agar cioccolato dopo 15-24 ore a 35-37°C) mucose, se il ceppo è capsulato la capsula si forma in presenza di CO2, o in terreni contenenti bicarbonato di sodio 0,7% 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Caratteristiche colturali (3) La rapidità di crescita (12-15 ore ) di B. anthracis può essere sfruttata per isolare il microrganismo da una coltura mista Al Gram i batteri cresciuti su AS in aria: non presentano capsula appaiono come lunghe catene di bacilli Gram-positivi contengono spore, più o meno numerose, centrali o subterminali, ovali, che non dilatano il corpo batterico. 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Morfologia delle colonie di B Morfologia delle colonie di B. anthracis (da agar sangue, dopo 18-24 ore) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Colonie “appiccicose” di B. anthracis, da agar sangue www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Test addizionali 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

B. cereus (destra) e B. anthracis (snistra), su agar sangue, dopo 24 ore www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it

Fonti bibliografiche ISS (www.iss.it) JAMA, 1999, Consensus statement N Engl J Med, 1999, Dixon e al. CDC (www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf) PHLS (www.phls.co.uk/advice/anthrax_guidelines.pdf) links: www.apsi.it 06.11.01 Antrace 4 - www.apsi.it