FAC SIMILE CORSO DI BIOLOGIA APPLICATA A.A. 2008/2009 TITOLO DEL SEMINARIO________________________________________________ DOCENTE__________________________________ NOME, COGNOME E MATRICOLA DELLO STUDENTE__________________________ ___________________________________________________________________________ SCHEMA DELL’ ELABORATO: Carattere, Times New Roman 12; interlinea 1,5; lunghezza massima, una pagina (4000 caratteri, spazi inclusi). INTRODUZIONE, BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA OBIETTIVI DEL LAVORO SPERIMENTALE RISULTATI CONCLUSIONI RISPOSTA AD UNA DOMANDA SPECIFICA FATTA IN AULA DAL DOCENTE (lunghezza compresa nei 4000 caratteri) Fare una domanda al docente

CRITERI GENERALI ADOTTATI PER LA VALUTAZIONE DEI COMPITI BUONO: 1) testo equilibrato nei contenuti e scorrevole alla lettura (scritto in modo chiaro e sintetico con concetti bene organizzati) 2) descritto (più o meno bene) almeno un esperimento. SUFFICIENTE: risponde solo a uno dei due requisiti, oppure solo parzialmente a entrambi i requisiti INSUFFICIENTE: non risponde a nessuno dei requisiti 1 e 2 eccede platealmente i limiti richiesti fuori tema (scopiazzato da oscuri siti internet ??) contiene baggianate di varia natura

CARATTERISTICHE VALUTATE POSITIVAMENTE -logica, semplicità, chiarezza espositiva -corrispondenza del contenuto a quanto trattato nel seminario -capacità di descrivere un esperimento CARATTERISTICHE VALUTATE NEGATIVAMENTE -contenuto non corrispondente a quanto trattato nel seminario -esposizione confusa, non strutturata -mancanza di capacità di sintesi (eccessiva lunghezza elaborato) -incapacità di esprimersi correttamente in italiano (grammatica, punteggiatura, sintassi) -non aver descritto neanche un esperimento

ACCORCIANDO I TELOMERI

Danno al DNA Spontaneo e/o indotto Causato da agenti endogeni prodotti dall’intrinseca attività cellulare. ABERRAZIONI CROMOSOMICHE Riparazione del danno Malriparazione o non riparazione del danno Ripristino della corretta informazione genetica Prodotto dall’interazione del DNA con agenti esogeni (fisici o chimici) a cui l’organismo può essere esposto.

Danno al DNA Gli effetti biologici dei danni permanenti nella sequenza del DNA sono essenzialmente sviluppo di tumori, invecchiamento precoce e malattie ereditarie

Aberrazioni cromosomiche Aberrazioni cromosomiche numeriche alterazione dell’apparato di divisione cellulare malsegregazione Aberrazioni cromosomiche strutturali SSB, DSB instabilità cromosomica Stabili Instabili G1 Metafase G1 Metafase delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni, G1 Metafase dicentrici, frammenti acentrici, cromosomi ad anello G1 Metafase G1 Metafase G1 Metafase G1 Metafase G1 Metafase

Aberrazioni cromosomiche nello sviluppo tumorale Le aberrazioni cromosomiche sono considerate eventi caratteristici della trasformazione tumorale ed una vasta gamma di aberrazioni sono state trovate in cellule tumorali (Mitelman 2000). In particolare, gli scambi bilanciati (traslocazioni reciproche) esercitano la loro azione nella trasformazione tumorale attraverso due meccanismi alternativi: la deregolazione di specifici geni, spesso l’overespressione genica, oppure attraverso la formazione di ibridi tra due geni (Mitelman et al. 1997) Il primo meccanismo può essere esemplificato dal linfoma di Burkitt dove tutte e tre le traslocazioni che caratterizzano questo tumore [t(8;14), t(8;22) e t(2;8)] portano all’attivazione del gene MYC (Mitelman 2000). Leucemia mieloide cronica (cromosoma Philadelphia) per la creazione di un gene di fusione nella traslocazione t9;22 in cui si ha la fusione tra una parte del gene ABL e una parte del gene BCR e la successiva trascrizione e traduzione di una proteina chimerica BCR/ABL (Mitelman 2000).

Stabilità cromosomica = stabilità telomerica

I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza TTAGGG

Sono caratterizzati da un filamento 3'-protrudente che si ripiega all’indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop. t-loop d-loop d-loop (T-loop) protegge le estremita cromosomiche da nucleasi e da attività cellulari che possono essere dannose per la sua integrità, come dall’attacco di proteine coinvolte nella riparazione.

La stabilità del T-LOOP è determinata Dalla LUNGHEZZA DELLE SEQUENZE TELOMERICHE Da: de Lange T. Protection of mammalian telomeres Oncogene. 2002, 21:532-40.

Dalle PROTEINE TELOMERICHE Dalle PROTEINE DELLA RIPARAZIONE presenti al telomero

STABILITA’ CROMOSOMICA= STABILITA’ TELOMERICA

Il ruolo dei telomeri è quello di stabilizzare le estremità cromosomiche lineari formando, quello che viene definito, un “cappuccio protettivo” che impedisce la possibilità di riarrangiamenti intra- ed intercromosomici. In studi effettuati su diversi tipi di tumore è stata riscontrata una correlazione tra la lunghezza telomerica e i riarrangiamenti cromosomici (Holzmann et al. 1993; Schwartz et al. 1993), suggerendo che la perdita di sequenze telomeriche preceda la formazione di aberrazioni cromosomiche.

THE END REPLICATION PROBLEM

Telomerasi La telomerasi, la trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni TTAGGG alle sequenze telomeriche, è il maggior regolatore della lunghezza telomerica nelle cellule di mammifero (collins & mitchell 2002). Consiste di due componenti principali: TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) - una subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica TERC (Telomerase RNA component) - una molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove ripetizioni telomeriche. Nell’uomo l’attività telomerasica è stata riscontrata nelle cellule della linea germinale ed in cellule embrionali ma non nella maggior parte dei tessuti adulti Il 90% dei tumori presentano attivazione della telomerasi (Greider, C. W. & Blackburn, E. H. 1989 A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature 337, 331–337.) (Chan srwl & Blackburn eh telomeres and telomerase. Phil. Trans. R. Lond. B 359, 109-21 2004).

LA TELOMERASI La telomerasi permette di risolvere il problema della replicazione delle estremità cromosomiche aggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo di sintesi del DNA

La telomerasi nello sviluppo dei tumori La telomerasi è presente in cellule tumorali e in cellule immortalizzate (Kim et al. 1994). La sua riattivazione in qualche passaggio dello sviluppo tumorale previene l’accorciamento critico dei telomeri e quindi l’arresto proliferativo in più del 90% dei tumori nell’uomo, e per questo, la sua abrogazione è stata proposta come un possibile meccanismo di inibizione della progressione tumorale (Blasco 2002).

TELOMERASI E TUMORE E’ stato dimostrato che la telomerasi è espressa nella grande maggioranza dei tumori. Quindi lo sblocco della telomerasi non è sufficiente, ma sembra essere necessaria per lo sviluppo e la proliferazione del tumore.

Analisi citogenetica di topi C57BL/6 e C57BL/6-p53+/- trattati con il Melphalan, un farmaco chemioterapico in grado di indurre aberrazioni cromosomiche. Gli esperimenti svolti hanno avuto l’obiettivo di mettere in relazione il background genetico dei ceppi murini utilizzati, l’instabilità cromosomica e le strutture telomeriche.

Il Melphalan Agente alchilante bifunzionale con due siti reattivi in grado di interagire con le basi del DNA È in grado di indurre: adotti al DNA attraverso il trasferimento di un gruppo alchile legami crociati (cross-link) intra ed interfilamento legami crociati tra DNA e proteine Induce aberrazioni cromosomiche sia in vivo che in vitro (Mamuris et al. 1989), attraverso la formazione di una rottura al DNA necessaria per risolvere il blocco della forca replicativa a livello del cross-link (agente S-dipendente) (Stevenson and Patel 1973).

Tecniche di citogentica molecolare Il “Chromosome Painting” grazie all’uso di sonde che ibridano interi cromosomi, permette di identificare i cromosomi in cellule in metafase ed in interfase (Tucker et al. 1993, 1995). La marcatura fluorescente di uno specifico cromosoma, permette di identificare ogni tipo di riarrangiamento tra questo cromosoma ed il resto del genoma.

Chromosome Painting

Tecniche di citogentica molecolare La Q-FISH è una FISH quantitativa negli ultimi anni utilizzata per la misura della lunghezza telomerica. Si basa sull’uso di sonde telomeriche di PNA (Peptide Nucleic Acid) fluorescenti. I valori di fluorescenza telomerica, che possono essere studiati per ogni singolo telomero, sono proporzionali alla lunghezza di tali strutture.

Q-FISH: quantificazione delle lunghezze telomeriche con il programma “ISIS” - Metasystem GmbH - Fluorescenza telomero T/C = Fluorescenza centromero del cromosoma 2

Protocollo sperimentale C57BL/6 Olio di mais C57BL/6 p53+/- Melphalan 2 mg/Kg/settimana Inizio trattamento 4 settimane 13 settimane Sacrificio prelievo del midollo osseo preparazione metafasi Sacrificio prelievo del midollo osseo preparazione metafasi Ibridazione in situ Ibridazione in situ Chromosome painting per i cromosomi 2 e 7 Q-FISH Chromosome painting per i cromosomi 2 e 7 Q-FISH

Induzione di aberrazioni cromosomiche totali a 4 e 13 settimane da parte del Melphalan * ** ** * -Dopo quattro settimane di trattamento in entrambi i genotipi si ha un aumento altamente significativo (P<0.01) nell’induzione di aberrazioni cromosomiche. -Confrontando i due genotipi, non sono state rilevate differenze statisticamente significative nella frequenza di aberrazioni cromosomiche -Aumento nell’induzione di aberrazioni cromosomiche totali in seguito al trattamento con il Melphalan per 13 settimane in entrambi i genotipi (P<0.05) - Il genotipo p53 eterozigote mostra una maggiore frequenza di aberrazioni cromosomiche spontanee ed indotte, sia rispetto al genotipo wild-type che al trattamento a 4 settimane.

Percentuale di aberrazione estrapolata all’intero genoma dopo 4 e 13 settimane

Lunghezze telomeriche dopo 4 e 13 settimane di trattamento con il Melphalan -A 4 e a 13 settimane di trattamento, i topi wild-type mostrano un accorciamento telomerico statisticamente significativo (P<0,01) rispetto ai loro controlli. -Al contrario, topi p53 eterozigoti non mostrano un accorciamento telomerico significativo dopo 4 settimane di trattamento, mentre si può osservare a 13 settimane di trattamento un allungamento telomerico altamente significativo (P<0,01).

Andamento delle lunghezze telomeriche 4 settimane 13 settimane

Fibroblasti umani primari HFFF2 5 10 15 20 25 30 35 40 4 Doses (Gy) Telomere length (T/C%) X-rays 3 MeV protons 1 day 4 days 15 days

More complex DNA DAMAGE Low LET radiations DNA DAMAGE Telomere lenghtening Immediate activation of telomerase or ALT mechanisms High LET radiations Delayed activation of telomerase or ALT mechanisms More complex DNA DAMAGE Telomere shortening

Conclusioni Il Melphalan induce aberrazioni stabili, soprattutto traslocazioni,in entrambi i genotipi È evidente una maggiore instabilità cromosomica spontanea ed indotta dovuta alla eterozigosità di p53 ma evidenziabile solo dopo un tempo sufficientemente lungo da permettere l’accumulo del danno. L’ accorciamento telomerico associato alla instabilità cromosomica indotta dal trattamento sia a 4 che a 13 settimane nei topi WT conferma il coinvolgimento dei telomeri nell’ instabilità cromosomica. Topi p53 eterozigoti a 4 settimane di trattamento non mostrano accorciamento telomerico malgrado la maggiore instabilità cromosomica rispetto al controllo, suggerendo che o la perdita di p53 o la maggior “quantità” di danno sia responsabile dell’attivazione di meccanismi di mantenimento delle lunghezze telomeriche.

Conclusioni Topi p53 eterozigoti dopo 13 settimane di trattamento evidenziano un allungamento delle sequenze telomeriche associata ad una più alta percentuale di aberrazioni cromosomiche rispetto al wild-type.Questo ci porta a formulare due ipotesi: 1) La perdita allelica di p53 potrebbe portare ad una riattivazione della telomerasi evidenziabile a quattro settimane con un mantenimento delle sequenze telomeriche allo stesso valore del controllo, e a tredici settimane con un incremento di tali sequenze rispetto al valore del controllo, ottenuto per i tempi di azione più lunghi a disposizione dell’enzima 2) considerando l’elevata instabilità cromosomica osservata nei topi p53+/-, ipotizzare una induzione dell’allungamento telomerico mediato dall’elevata l’instabilità cromosomica