L’effetto ossigeno in radiobiologia Università Cattolica del Sacro Cuore Scuola di specializzazione in Fisica Sanitaria 2003-2004 Claudia Dell’Omo

FATTORI CHE INFLUENZANO L’EFFETTO DELLE RADIAZIONI Fattori fisici Fattori biologici Fattori chimici

Fattori fisici: alta o bassa intensità la dose può essere somministrata come dose singola o frazionata alto o basso trasferimento lineare di energia (LET) basso LET alto LET Curve di sopravvivenza di cellule dopo irradiazioni con dose di raggi x e neutroni.

Sopravvivenza della capacità riproduttiva di cellule HeLa Fattori biologici: fasi del ciclo cellulare in rapporto all’efficacia delle radiazioni nel provocare la morte cellulare recupero del danno radiosensibilità e radioresistenza dei tessuti in riferimento alla loro attività proliferativa e al grado di differenziazione Esistono differenze di un fattore o due nella dose richiesta per un determinato livello di morte cellulare tra le diverse fasi del ciclo. Sopravvivenza della capacità riproduttiva di cellule HeLa irradiate con raggi x in quattro differenti momenti del ciclo cellulare: M, G1, G2 e fase S del DNA.

Fattori chimici: protettori: agenti che riducono l’effetto di una determinata dose di radiazione sensibilizzanti: agenti che aumentano l’efficacia di una determinata dose di radiazione, l’ossigeno è un potente “sensibilizzante”. In presenza di O2 tutti i sistemi biologici sono molto più sensibili alla radiazione Il grado di sensibilizzazione è espresso in termini di “Oxygen Enhancement Ratio”: per produrre lo stesso effetto biologico.

Oxygen Enhancement Ratio – x rays OER ha valori tipici di 2,5 – 3 per raggi x e  curva A: cellule ben ossigenate curva B: cellule poco ossigenate Per un livello di effetto E, la dose in condizioni di ossigenazione (4 Gy) è 2,5 volte inferiore alla dose richiesta in condizioni di ipossia (10 Gy). O2 è perciò un agente dose-modifying per radiazioni a basso LET. Curve di sopravvivenza per cellule esposte a raggi x in condizioni ipossiche e non.

Oxygen Enhancement Ratio –altre radiationi OER ha valori tipici < 2 per radiazioni densamente ionizzanti Curve di sopravvivenza per cellule esposte a radiazioni adroniche in condizioni ipossiche e non. Per radiazioni ad alto LET, si nota una diminuzione dell’OER al crescere del LET. Ad esempio, per particelle  (la curva di sopravvivenza non ha la spalla cioè è una funzione esponenziale della dose), le cellule ipossiche ed ossigenate vengono uccise con uguale facilità, ciò vuol dire OER = 1.

l’O2 non modifica l’effetto della radiazione ad alto LET. Efficacia dell’O2 come agente modificante per le radiazioni ad elevato e basso LET Coppie di curve di sopravvivanza per cellule sottoposte ad irradiazione a LET elevato e basso in condizioni di ossigenazione e di ipossia. Nel primo caso l’OER  1 l’O2 non modifica l’effetto della radiazione ad alto LET.

Perché c’è riduzione dell’effetto O2 Relazione tra LET, EBR ed OER Perché c’è riduzione dell’effetto O2 all’aumentare del LET? Spiegazione più probabile: nei densi percorsi di ionizzazione delle radiazioni ad elevato LET c’è produzione di O2 , questo ossigena e così sensibilizza le cellule al momento dell’irradiazione.

Tempi di azione Affinchè si osservi l’effetto ossigeno, è necessario che l’ossigeno sia presente: - durante l’esposizione alla radiazione Wright, Howard-Flanders, Acta Radiol 48, 1957 Howard-Flanders P., Moore D., Radiat Res 9, 1958 entro pochi millisecondi dopo l’irradiazione Michael BD et al., Radiat Res 54, 1973 L’idea di questo ultimo esperimento è che l’ossigeno, contenuto in una camera ad alta pressione, venga fatto esplodere su uno strato singolo di batteri in vari tempi: prima, durante e dopo l’irradiazione con un impulso di elettroni di 2 sec dato da un acceleratore lineare. Il risultato è che l’ossigeno agisce come sensibilizzante se esso viene aggiunto non più tardi di 5 msec dopo l’irradiazione.

Concentrazione richiesta di ossigeno Assegnando 1 alla radiosensibilità in condizioni anossiche, si trova sperimentalmente che essa diventa 3 in condizioni di ossigenazione. La variazione di sensibilità si realizza soprattutto quando la concentrazione di ossigeno passa da 0 a 30 mm Hg. Dopo, si realizza un plateau. Dipendenza della radiosensibilità dalla concentrazione di ossigeno.

Il meccanismo dell’effetto ossigeno (1) Catena di eventi Limiti di tempo Interazioni iniziali Radiazioni indirettamente ionizzanti (X, , n) 10-24 – 10-14 s Radiazioni direttamente ionizzanti (e-, p) 10-16 – 10-14 s Stadio fisico-chimico Deposito di energia come ionizzazioni delle strutture molecolari lungo il percorso 10-12 – 10-8 s Danno chimico Radicali liberi 10-7 s - ore Danno biomolecolare Proteine, acidi nucleici ms - ore Effetti biologici precoci Morte cellulare, morte animale ore - settimane Effetti biologici tardivi Induzione di neoplasie, effetti genetici anni - secoli

Radiochimica dell’acqua; ipotesi della fissazione del danno H2O H2O+ + e- e- + H2O H2O- radiation H2O+, H2O- sono instabili: H2O+ H + + OH° H2O- H ° + OH - H°, OH° sono radicali liberi, cioè atomi o molecole elettricamente neutri aventi un elettrone spaiato rispetto allo spin nell’orbita esterna. Sono molto reattivi, con una grande tendenza ad accoppiare l’elettrone spaiato (ossidante) oppure a eliminare l’elettrone spaiato (riducente). Ad es., possono estrarre idrogeno da molecole organiche RH: RH + OH° R° + H2O RH + H° R° + H2 R° sono radicali liberi secondari che possono interagire con molecole biologicamente importanti e provocare danni azione indiretta delle radiazioni ionizzanti In presenza di O2: Formazione del radicale organico perossido, che può attivare una reazione a catena che coinvolge più RH R° + O2 RO2° Fissazione del danno biologico, cioè cambiamento stabile della composizione chimica del target  potenziamento dell’efficacia delle radiazioni RO2° + RH RO2H + R°

Il meccanismo dell’effetto ossigeno (2)

Effetto ossigeno e radioterapia Thomlinson & Gray (1955) key paper Conclusioni schematizzate del lavoro di Thomlinson e Gray: ogni centro tumorale con raggio maggiore di 200 m presenta un centro necrotico nessuna necrosi è presente in tumori con raggio minore di 160 m Comunque grande sia il raggio del centro necrotico, lo spessore esterno composto di cellule tumorali attive non è mai maggiore di 180 m ed è sempre compreso tra 100 m e 180 m. L’area delle cellule tumorali attive appare, in sezione, come un anello Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano.

Effetto ossigeno e radioterapia Diffusione dell’O2 da un capillare Conclusioni del lavoro di Thomlinson e Gray: Le cellule tumorali proliferano e crescono attivamente soltanto se sono in prossimità di una sorgente di ossigeno o nutrienti (stroma). Fino a 150 m dal capillare le cellule sono ossigenate; a distanze maggiori l’ossigeno è consumato e le cellule diventano necrotiche. Le cellule ipossiche formano uno strato (di una o due cellule) nel quale la concentrazione di ossigeno è alta abbastanza da permettere la loro attività e bassa abbastanza da renderle relativamente protette dagli effetti dei raggi x. 150 m Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano.

Effetto ossigeno e radioterapia Powers & Tolmach, 1973 Prima evidenza di cellule ipossiche in tumore La curva ha due distinte componenti, di due diverse pendenze (bifasica). Ciò suggerisce che il tumore consiste di due gruppi separati di cellule, uno ossigenato e l’altro ipossico. Estrapolando dalla regione di alte dosi all’asse di sopravvivenza si ottiene la frazione di cellule ipossiche al tempo di irradiazione: livello di sopravivvenza = 1 % Circa 1 % delle cellule clonogeniche nel tumore hanno una curva di sopravivvenza tipica di cellule ipossiche. Risposta alla radiazione di un linfosarcoma subcutaneo solido nel topo A basse dosi (< 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ossigenate. Ad alte dosi (> 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ipossiche. Prima evidenza inequivocabile che un tumore solido contiene una percentuale di cellule clonogeniche sufficientemente ipossiche da essere radioresisrtenti

Effetto ossigeno e radioterapia Determinazione pratica della frazione di cellule ipossiche curva aerobica Animale respira aria Mistura di cellule ipossiche e aerate curva ipossica Animale asfissiato mediante respirazione di N2 curva ossica Cellule in vitro in O2 Mouse tumour La frazione ipossica è  20 %: (la distanza verticale tra la curva ipossica e quella in aria sull’asse della frazione di sopravvivenza va da 1.0 a 0,2)

Effetto ossigeno e radioterapia Introduzione alla reossigenazione Sperimentalmente è stato dimostrato che la proporzione di cellule ipossiche nel tumore è circa costante, cioè la stessa sia nel tumore non trattato che dopo il trattamento frazionato. Spiegazione: durante il trattamento, le cellule si muovono dal compartimento ipossico a quello ossigenato. Se così non fosse la proporzione di cellule ipossiche dovrebbe aumentare durante il trattamento perché la radiazione dovrebbe spopolare più il compartimento delle cellule aerate che quello delle cellule ipossiche REOSSIGENAZIONE

Effetto ossigeno e radioterapia Il meccanismo della reossigenazione I tumori umani si reossigenano rapidamente ed efficientemente, come la maggior parte di quelli animali, tra due frazioni di dose. Ogni frazione di dose uccide una proporzione molto più grande di cellule ossigenate che di cellule ipossiche. Il processo di riossigenazione ristabilisce la proporzione di cellule ipossiche (ad es. all’ 1 %) prima che venga irradiata la prossima frazione di dose, quindi il compartimento di cellule ipossiche non diventa mai dominante. Mentre il numero di cellule ossigenate diventa sempre più piccolo, sempre più cellule ipossiche si muovono nel compartimento ossigenato per mantenere la proporzione di cellule ipossiche all’ 1 %. La morte delle cellule che erano ipossiche all’inizio del trattamento è perciò un risultato della loro irradiazione quando sono diventate ossigenate.

Effetto ossigeno e radioterapia conclusione La presenza di un piccolo numero di cellule ipossiche (radioresistenti) può spiegare la differenza tra il successo e l’insuccesso nella terapia di un tumore. Esse rappresentano un focus per la ricrescita del tumore. Dose di radiazioni necessaria per uccidere tutte le cellule nei volumi indicati. Si ipotizza che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente ed efficientemente.

Effetto ossigeno e radioterapia conclusioni Tumori (animali) includono Cellule aerate Cellule ipossiche L’ipossia conferisce protezione da Raggi x Agenti Chemioterapici La presenza of O2 aumenta il “cell killing” La reossigenazione delle cellule ipossiche può migliorare il trattamento contro il tumore mediante “radiation therapy”. E’ una ipotesi plausibile che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente ed efficientemente.