Prodotti da geni clonati nativi e manipolati Biologia Molecolare Prodotti da geni clonati nativi e manipolati

Outline Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati Espressione dei geni clonati nei batteri Espressione in cellule eucariotiche

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati I batteri vengono spesso utilizzati come sistemi per l’espressione di geni clonati.

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati TRASCRIZIONE Il fattore più importante è il promotore I batteri controllano quali regioni esprimere e quali quantità produrre Le sequenze regolative si sono evolute insieme alle seuenze codificati dei batteri I segnali di trascrizione eucariotici sono sostanzialmente diversi Utilizzo di VETTORI DI ESPRESSIONE Utilizzo di cDNA invece che di DNA

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati Per la produzione del prodotto proteico è determinante la quantità di RNA disponibile per la traduzione: Velocità di sintesi Stabilità del messaggero Ma nei batteri la stabilità del messaggero è meno importante che negli eucarioti perché la vita media dei messaggeri è molto ridotta. Più facile manipolare il transcription rate che la stabilità La trascrizione può anche essere influenzata dal contenuto di CG

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati INIZIO DELLA TRADUZIONE

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati INIZIO DELLA TRADUZIONE Il ribosoma si lega in prossimità del codone di inizio attraverso il riconoscimento della sequenza shine-dalgarno (complementare a parte dell’rRNA 16s) Distanza tra shine-dalgarno codone di start variabile

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati CODON USAGE Il codice genetico prevede l’utilizzo di codoni sinonimi Non tutti i codoni però funzionano allo stesso modo Diversa disponibilità dei tRNA L’utilizzo dei codoni precede un uso preferenziale che si chiama codon bias

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati CODON BIAS Il fenomeno è più accentuato per i geni molto espressi Pressione evolutiva per la selezione di codoni più abbondanti (selezione dei codoni e selezione dei tRNA) Questo fenomeno si riflette nell’efficienza di espressione di un gene clonato in un organismo diverso da quello di partenza Se non si riscontra alcun prodotto proteico?

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati Utilizzo alternativo dei codoni In alcune specie batteriche UGA->triptofano In E. coli UGA -> STOP -> per esprimere questi geni in E. coli bisogna ingegnerizzare il gene (complesso) o fornire all’ospite i tRNA specifici.

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati GC content Effetti sulla trascrizione (melting alterato) Effetti sul codon usage: Il codon usage può essere “pressato” a selezionare soltanto codoni che rispettino il GC content previsto Esistono variazioni tra il 30 ed il 70%

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati

Fattori che influiscono sull’espressione dei geni clonati Caratteristiche del prodotto proteico Stabilità della proteina Localizzazione della proteina Utilizzo di sequenze segnale per la secrezione La proteina viene secreta nel mezzo di coltura Volume del mezzo di coltura superiore alla somma dei volumi dei citoplasmi (possibilità di produrre più proteina senza incorrere in concentrazioni eccessive) Anche con la sequenza segnale la proteine potrebbe non passare attraverso la membrana Modificazioni post traduzionali (glicosilazione, taglio) Questo rappresenta il principale stimolo all’utilizzo di ospiti non batterici

Espressione dei geni clonati nei batteri Necessità di avere un promotore funzionante nell’ospite. Utilizzo di un vettore di clonazione che presenta tale promotore: l’inserimento del gene a valle del promotore genera un una unità trascrizionale per fusione trascrizionale.

Espressione dei geni clonati nei batteri In E. coli vengono spesso utilizzati promotori derivati da lac e trp Possono essere creati promotori ingegnerizzati derivati dai promotori naturali per aumentarne la forza Il promotore tac -> lac+trp Il numero di copie del plasmide ha un effetto sulla concentrazione finale del prodotto: Poiché i plasmidi originali possiedono elementi di controllo del numero di copie è possibile indurre un aumento del numero di copie rimuovendo alcuni elementi di controllo

Espressione dei geni clonati nei batteri Maggiore efficienza nella produzione del prodotto proteico Alta resa della produzione totale della proteina in termini di prodotto per litro di coltura Percentuale minore di proteine (ed altro materiale) contaminanti

Espressione dei geni clonati nei batteri STABILITA’: ESPRESSIONE CONDIZIONALE Troppa proteina -> inibizione della crescita (proteina dannosa o proteina non dannosa) In queste condizione i mutanti non produttivi vengono selezionati per un vantaggio selettivo (effetto non voluto) Per evitarlo è possibile la selezione con antibiotico -> Problemi per lo smaltimento Soluzione: promotori controllabili (lac o trp)

La regolazione dell’espressione genica La regolazione dell’espressione genica è di grandissima importanza anche nei procarioti. Non tutti gli enzimi della cellula devono essere sintetizzati contemporaneamente e non tutti devono essere sintetizzati nella stessa quantità. La regolazione è fortemente influenzata dall’ambiente proprio per permettere al batterio di rispondere in maniera efficace alle variazioni nel mezzo in cui il batterio si trova. L’induzione e la Repressione rappresentano due efficaci meccanismi di regolazione dell’espressione genica operati dal batterio. Essi permettono al batterio di sintetizzare gli enzimi necessari soltanto quando servono.

La repressione Gli enzimi che catalizzano la sintesi di un prodotto non vengono sintetizzati se questo prodotto è già presente nel mezzo. La repressione dei sistemi enzimatici deputati alla sintesi di un dato composto è effettuata dal composto stesso che, se presente nel mezzo, assume il ruolo di repressore. La repressione è un fenomeno estremamente diffuso, ed è altamente specifico. Il vantaggio della repressione è ovvio: l’organismo non spreca la propria energia per la sintesi degli enzimi non necessari.

L’induzione L’induzione enzimatica, o semplicemente induzione, rappresenta il fenomeno attraverso il quale la sintesi di un enzima è attivata soltanto quando il suo substrato è disponibile. Un esempio è dato dagli enzimi per la degradazione di sostanze energetiche. Questi vengono prodotti esclusivamente se le sostanze da degradare sono presenti nel mezzo, e possono quindi essere utilizzate. La sostanza che inizia l’induzione enzimatica è chiamata induttore La sostanza che reprime la produzione di enzimi è chiamata corepressore (perché richiede l’intervento di una proteina addizionale chiamata repressore) Queste sostanze, che di solito sono piccole molecole, vengono collettivamente definite effettori

Induzione e Repressione Come fanno gli effettori ad influenzare i geni bersaglio in maniera così specifica? Legando combinandosi con proteine di regolazione specifiche Quando un corepressore lega una proteina di regolazione (repressore) la rende capace di legarsi in una specifica regione di DNA a valle del promotore detta operatore. Il legame di questo complesso impedisce alla polimerasi di proseguire e di sintetizzare l’mRNA dei geni a valle. I geni bersaglio sono tutti posizionati a valle della regione operatore, vengono quindi controllati simultaneamente. Questo tipo di organizzazione viene chiamata operone.

Repressione Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Trascrizione RNA polimerasi repressore Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 repressore RNA polimerasi Trascrizione Bloccata corepressore

Induzione Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 repressore RNA polimerasi Trascrizione Bloccata Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 RNA polimerasi Trascrizione repressore induttore

Il controllo positivo La repressione e l’induzione sono meccanismi di controllo negativo dell’espressione in quanto in entrambi i casi è coinvolta una proteina regolatrice specifica, chiamata repressore, che impedisce la sintesi dei geni di un operone. Nel controllo positivo una proteina regolatrice promuove il legame della RNA polimerasi agendo così in modo da incrementare la sintesi degli mRNA regolati. Le proteine regolatrici che intervengono in questo processo sono chiamate attivatori (o proteine di attivazione) I siti di legame per gli attivatori possono talvolta essere localizzate a distanza dai promotori. In questo caso la loro azione è mediata dal ripiegamento del DNA (secondo un modello simile a quello incontrato per gli enhancer eucariotici)

Repressione Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 La trascrizione non ha inizio attivatore RNA polimerasi Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 attivatore RNA polimerasi Trascrizione induttore

Operon lac L’operone del lattosio, in E. coli ha un doppio tipo di controllo, basato sia sulla induzione che sulla repressione. Questo permette al batterio di utilizzare il lattosio solo quando questo è disponibile e solo quando non sono presenti nel mezzo delle fonti energetiche più appetibili

Operon lac

Operon lac

L’attenuazione Un’altra modalità di controllo nota come attenuazione è utilizzata in alcuni operoni che controllano la sintesi degli aminoacidi. Il caso più conosciuto è quello della via biosintetica dell’aminoacido triptofano. L’operone del triptofano possiede diverse modalità di regolazione, una di queste è appunto l’attenuazione che prevede la presenza di una particolare sequenza, chiamata sequenza guida, all’interno della quale è presente una regione codificante per un polipetide. Questo polipeptide ha tre codoni per il triptofano consecutivi.

L’attenuazione L’attenuazione, nell’operone triptofano, è possibile soltanto perché nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiate: la traduzione inizia prima che la sintesi dell’mRNA sia terminata. Lo spostamento del ribosoma sull’mRNA in formazione può influenzare il ripiegamento dell’mRNA stesso nascondendo delle regioni complementari. La terminazione prematura della trascrizione è influenzata proprio dalla formazione di strutture secondarie tipiche

L’operone triptofano L’operone del triptofano è sempre acceso. La polimerasi comincia a produrre mRNA messaggero. Il ribosoma si attacca e comincia a produrre il polipeptide codificato dalla sequenza dell’attenuatore Se vi è una elevata presenza di triptofano la velocità del ribosoma è elevata, il ribosoma raggiunge la regione 2 e le impedisce di legarsi, per complementarietà, alla regione 3. In questo modo la regione 3 si appaia con la regione 4 formando una struttura che induce la terminazione della trascrizione

L’operone triptofano Se il triptofano è scarso, quando il ribosoma arriverà in corrispondenza dei tre codoni per il triptofano effettuerà una pausa. La diffusione degli aminoacil-tRNA per il triptofano è infatti più lenta e il ribosoma deve aspettare che questi arrivino. La sosta del ribosoma nella zona 1 non impedisce alla zona 2, che questa volta è libera, di appaiarsi con la regione 3. Non potendosi più formare la struttura di terminazione (perché la regione 3 è impegnata e non disponibile per l’appaiamento con la regione 4) la trascrizione continua a valle producendo un mRNA con i geni per la biosintesi del triptofano.

Espressione dei geni clonati nei batteri FUSIONI TRADUZIONALI Una parte della proteina deriverà dal nostro inserto ed una parte dal vettore ORIENTAMENTO FRAME DI LETTURA CONTROLLARE IL PRODOTTO RICOMBINANTE PER SEQUENZIAMENTO