Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene  principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle piante. Sebbene molte delle tecniche descritte sono utilizzate esclusivamente in ambito vegetale, le strategie generali possono essere generalizzate anche ad altri sistemi. Il metodo classico per determinare la funzione di un gene si basa sulla ricerca e interpretazione di mutazioni in quel gene. Questo metodo si basa sulla mutagenesi sistematica delle sequenze geniche e produce collezioni di mutazioni (prevalentemente recessive) di tipo “loss of function”. La caratterizzazione genetica e funzionale di queste mutazioni riesce, in molti casi, ad assegnare una funzione al gene in analisi. A partire da questa informazione si risale alla sequenza genica, utilizzando varie tecniche di clonaggio. Questo approccio che parte dalla funzione per risalire al gene è noto come genetica diretta (forward genetics).

La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato l’approccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Per esempio è possibile generare piante transgeniche ed esprimere il gene in versione senso o antisenso, per studiarne il fenotipo e, da questo, cercare di dedurre la funzione del gene. Formalmente questo significa generare mutazioni (dominanti) di tipo “gain of function” Allo stesso scopo, ma in maniera più sistematica, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene d’interesse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa (reverse genetics).

Gene Gene Fenotipo??? Fenotipo FORWARD REVERSE PCR-screening mutante T-DNA Fenotipo FORWARD Gene Funzione Gene REVERSE PCR-screening Funzione???

per studiare la funzione di un gene nelle piante Strategie molecolari per studiare la funzione di un gene nelle piante Aumento espressione del gene endogeno: forte costitutiva ectopica inducibile Riduzione/silenziamento del gene endogeno: AntiSENSO RNAi co-soppressione, Knock Out del gene..... genetica forward genetica reverse

per studiare la funzione genica Strategie genetiche per studiare la funzione genica Inattivazione di un gene per identificare e caratterizzare un fenotipo Non tutti i geni sono “mutagenizzabili” perché: geni funzionalmente ridondanti (geni a funzione simile ma non omologhi) (ridondanza strutturale v/s ridondanza funzionale) geni coivolti in diverse fasi dello sviluppo, e mutazioni in tali geni possono causare fenotipi letali o pleiotropici

Knock Out del gene..... mutagenesi sito-specifica v/s mutagenesi inserzionale “random” Nelle piante No mutagenesi sito-specifica !!!!! Quindi............ mutagenesi inserzionale “random”

Strategie di Mutagenesi Inserzionale a) T-DNA mutageno inserzionale che produce inserzioni stabili no “hot spots” di integrazione b) Trasposoni il trasposone può essere exciso dal gene inattivato (reversione del fenotipo = complementazione) eventi di trasposizione avvengono in zone limitrofe al sito di inserzione

Transposon tagging Il sistema Ac/Ds (agente in trans) Elementi Ac: (4563 bp) codificano per una trasposasi Elementi Ds: corrispondono ad elementi Ac deleti della trasposasi Caratteristiche del sistema Ac/Ds in mais: contiene delle IR di 11-bp alle estremità, essenziali codifica per una proteina di 92kDa con attività di trasposasi 101 aa N-ter non necessari per la trasposizione circa 200 bp ad ogni estremità sono necessari per la trasposizione la trasposasi lega un esamero AAACGG dopo trasposizione vengono generati dei DR di 8-bp altri residui di DNA vengono lasciati a seguito della trasposizione gli elementi DS sono deleti o della trasposasi o delle IRs

Transposon tagging Barbara Mc Clintock è stato il 1°scienziato a predirre che i trasposoni, elementi genetici mobili, erano presenti nei genomi eucariotici. Lei ha isolato il sistema Ac/Ds da mais. Il sistema Ac/Ds è stato utilizzato in Arabidopsis x generare collezioni di mutanti. La bassa attività dell’elemento Ac, è stata aumentata usando la trasposasi sotto il 35S. Cmq la frequenza di reinserzione dell’elemento Ac è relativamente bassa. Ciò puo’ anche dipendere da successive trasposizioni dell’elemento, dovuto a mancato controllo dell’attività di trasposizione. Un’alternativa a ciò è l’uso della trasposasi sotto controllo di un promotore HS. Elementi trasponibili isolati da mais e Antirrhinum sono utilizzati in altre specie nelle quali risultano assolutamente attivi.

Vantaggi del Transposon Tagging Evitare mutazioni indesiderate (dovute all’evento di trasformazione).Cosi la mutagenesi è separata dalla trasformazione perchè la trasposasi ed il trasposone/T-DNA (Ds)sono trasformati in 2 diverse piante. La trasposizione avviene solo in seguito all’incrocio tra le due linee. Ottenere mutazioni stabili che possono revertire. Una mutazione causata da un trasposone inerte è stabile finchè il trasposone non è mobilizzato da una trasposasi, in seguito a reincrocio. Quando il trasposone salta lascia il “footprint”, ma il fenotipo PUO’ comunque revertire. Ottenere nuove mutazioni. Quando il trasposone salta e lascia il “footprint” questo può causare una nuova mutazione (frameshift, inserzioni aminoacidiche) “Taggare” il gene d’interesse x inserzione. I trasposoni di tipo Ac fanno trasposizioni “short-range”. Identificando una linea con trasposone inerte che mappa vicino al gene d’interesse, si mobilizza il trasposone x incrocio con la trasposasi e si seleziona il “salto” nel gene.

T-DNA tagging RISULTATI Inserzione del T-DNA nel genoma vegetale mediante una “illegitimate recombination” No hot spots di integrazione Distribuzione random sui 5 cromosomi di Arabidopsis Produzione di >18000 FSTs (Flanking Sequence Tags) x analisi dei T-DNA IS RISULTATI 40% delle integrazioni sono in geni Nessuna categoria di geni è particolare bersaglio di integrazione FSTs più frequenti negli introni che negli esoni (43FSTs/Mb v/s 33FSTs/Mb) LB spesso integrato full-length, mentre RB risulta spesso troncata Coinvolgimento di “microsimilarità” tra LB e la sequenza vegetale preIS Integrazione influenzata anche dalla composizione nucleotidica Preferenza per regioni T-rich (i.e. promotori e introni)

Mutagenesi inserzionale “genomica” Quante linee bisogna produrre per saturare il genoma? Calcolo teorico: Il T-DNA si inserisce nel genoma seguendo una distribuzione di Poisson, quindi…… F (geni con almeno 1 inserzione= saturazione) = 1 - e-m dove m rappresenta il numero medio di eventi per gene, i.e. m = numero di inserzioni indipendenti/numero di geni Se: 1.5 T-DNA locus per line 75/85% saturazione con 25.000 T-DNA lines Ma noi evidenziamo solo inserzioni in regioni codificanti, quindi ….CORREZIONE! 95% saturazione con circa 50.000 linee indipendenti

Strategia di Isolamento Mutanti Raccolta semi T1 In Planta Vacuum Infiltration T0 Autoimpollinazione Selezione in serra dei trasformanti T1 Basta resistenti T2 Raccolta semi T2 Analisi in vitro delle plantule Kr Ks Kr Analisi dei mutanti Kana resistenti Propoagazione di piante omo ed eterozigoti

Knockology

Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle “Flanking Sequences”

Analisi di segregazione T2 Plants aa(Kr/Kr) Aa(Kr/Ks) AA(Ks/Ks) Total 96 193 94 383 1 2 1 autoimpollinazione T3 Plants xy1(Kr) WT(Kr/Ks) Ks Total a 24 47 26 97 b 25 46 24 95 c 27 55 28 110 e 121 0 0 121

Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle “Flanking Sequences”

GUS KanR Erbic R Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA 0,23 4,4 Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA x Kb fino al sito EcoRV sul DNA vegetale x E.RV E.RV E.RV RB LB GUS KanR Erbic R nos3’ ocs3’ Pnos 35S

Caratterizzazione Molecolare NT Caratterizzazione Molecolare del sito di inserzione 0,23 Kb 4,4 Kb 1,8 Kb RB-LB IR 1,2 Kb RB-RB DR

Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Clonaggio delle “Flanking Sequences” Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana)

Analisi per PCR Estrazione DNA dai singoli mutanti (da seme/embrione se il fenotipo è letale) PCR con oligo specifici per il T-DNA: Kana, RB, LB, Basta Analisi dei prodotti di PCR su gel/Southern blotting

Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle “Flanking Sequences”

Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

Ligazione intramolecolare T-DNA Kana GUS X Ori Amp Digestione T-DNA X Ligazione intramolecolare T-DNA X X Trasformazione E.coli Selezione colonie AmpR, su LB+Amp

Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

T-DNA X Kana GUS Digestione X T-DNA Ligazione intramolecolare PCR CC

Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante

Libreria genomica da DNA mutante Digestione del DNA genomico mutante (omozigote) o di plantula KanaR (eterozigote) con enzimi adeguati x il clonaggio Clonaggio del DNA genomico così digerito, in vettori x librerie genomiche (l, cosmidi) Trasformazione (per elettroporazione) di cellule competenti di E.coli Screening della libreria genomica con sonda T-DNA (Kana, RB, LB, Basta) Isolamento dei cloni positivi, sequenza delle FS Amplificazione delle FS x utilizzarle come sonda su una libreria genomica/cDNA WT Isolamento della copia WT del gene/cDNA che, inattivato, è responsabile del fenotipo

dipende dall’inserzione del T-DNA, Il fenotipo mutante dipende dall’inserzione del T-DNA, cioé dall’inattivazione del gene X ??? DIMOSTRAZIONE FORMALE: COMPLEMENTAZIONE!!!!!!! Complementazione: Trasformazione della pianta mutante con una copia del gene WT, al fine di restaurare la funzione mancante p35S::cDNAX pX::cDNAX pX::geneX

Un esempio: I mutanti pasticcino

pas1 WT WT pas1 V S N E V N N X B E N E N X S X T-DNA RB GUS LB