U2BP 3’ 5’ AAG GCA 47 51 52 A AAG GCA 47 52 AAAAA

U1 or U7 Double 3’ 5’ AAG GCA 51 47 52 AAG GCA 47 52 AAAAA

pBabe puro gag puro LTR LTR U1/U2 /U7 gag puro p antis LTR LTR SV40

Muscular biopsy from a D48-50 patient CELLULAR SYSTEM Muscular biopsy from a D48-50 patient Immortalization with Large T Antigen Infection with retroviral vectors containing the different therapeutic RNAs Puromycin selection Analysis of the expression of the transgene RT-PCR and western analysis

U1-5’ U2BP In vivo expression of antisense RNAs M C U1-5’ M C U2BP 3 ' 238 217 U1-5’ 201 190 180 160 3 ' 5 ' A A U U U U U C U C A U A C C U U C U G C U U G A U probe M C U2BP 307 U2BP ' 3 238 5 ' 217 201 190 A A A A A G A A G A A A A A G A A A A A U U A G A A A C 180 probe

RT-PCR (single antisense) 51 47 51 52 53 RT U1-5’ Duch 47 51 52 47 52 + - U2BP Duch U7d U1-5’ M

RT-PCR (double antisense) 47 51 52 53 RT Duchenne 5’-3’ dBP 5’BP C M 47 51 52 47 52 AAG GCA

Western analysis -427 kDa - Duchenne 5’-3’ 5’BP SMC dyst dBP 100 mg of total proteins Duchenne 5’-3’ 5’BP SMC dyst dBP - -427 kDa

In mioblasti DMD si ha ripristino di sintesi di distrofina e del complesso del sarcoglicano

Verso un approccio di terapia genica

pre-mRNA della distrofina Modello animale del topo mdx STOP pre-mRNA della distrofina 22 23 24 AAAAA traduzione 22 24 23 STOP 22 24 23 degradazione Splicing mRNA

Trasduzione in vivo di molecole antisenso:uso di vettori AAV Il virus AAV ha un’alta efficienza di trasduzione nei muscoli e non è patogenico U1/U7 promoter Antisense CMV Wpre GFP 5’-ITR 3’-ITR SV40 misc intron BGH pA Iniezione intramuscolo Somministrazione sistemica mediante iniezione nella vena caudale I muscoli iniettati vengono analizzati per: - analisi molecolare, (RT-PCR, Western) - immunoistochimica - saggi funzionali

La distrofina localizza correttamente alla periferia delle fibre e l’espressione è mantenuta per diversi mesi Iniezione intramuscolo

Anche il complesso distrofina-sarcoglicano è ripristinato

Iniezione sistemica di AAV-U1 estensore tricipite Gluteo dorso Gastrocnemio tibiale quadricipite * diaframma *cuore

Localizzazione di distrofina e complesso sarcoglicano

Saggi funzionali - Creatin kinasi I topi iniettati hanno livelli serici più bassi di CK 15000 1000 5000 wt mdx U1 / b 6 l x m d U 7

Saggi funzionali - Forza I topi iniettati mostrano recupero della forza muscolare 6 m 4 2 / N k 2 7 c 5 wt mdx U1 U7 / b 6 l x m d U 7 U 1 wt mdx GFP+ GFP- singole fibre

Saggi funzionali - Treadmill exhaustion test I topi iniettati mostrano aumento della resistenza allo sforzo Wt mdx AAV-U1

Settembre 2006 - Stato dell’arte per una sperimentazione di terapia genica della DMD basata sull’approccio dell’exon skipping mediato da AAV-U1 Vettore AAV9 in sostituzione di AAV1 (tale vettore risulta avere un tropismo per il muscolo molto maggiore di AAV1 e in particolare per il muscolo cardiaco) Collaborazione con il gruppo del Prof. Barry Byrne (Florida) capo del National Gene Vector Laboratories (NGVL) per la produzione di virus ricombinanti di purezza GMP e per analisi tossicologica Registrazione di AAV9-U1 come farmaco orfano. Elaborazione di un CTD (Common Technical Document) da sottoporre all’ISS, e successivamente all’EMEA, per la richiesta di autorizzazione a sperimentazione clinica e registrazione del farmaco

PTC124 (PTC therapeutics) Stato dell’arte della sperimentazione clinica su DMD PTC124 (PTC therapeutics) Plasmide codificante distrofina full-length (Transgene e Mirus) Intramuscolare (completato) Intravena (comincia inizio 2007) AAV1 codificante microdistrofina (AskBio) Exon skipping con oligonucleotidi: 2-O-metil fosforotioato contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007, Universita’ di Leiden e Prosensa) Morfolino contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007; UK MDEX Consortium) Fosforotioati contro esone 19, 1 soggetto (intravena, completato, Dr. Takeshima) Exon skipping con U7 snRNA : Fase di preparazione di un AAV2/1 (Danos - Genethon)

Strategia generale per la costruzione di un vettore virale I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali si sfrutta questa segragazione per progettare vettori virali ricombinanti. I geni virali e le sequenze che agiscono in cis sono separate su diverse molecole i prodotti dei geni virali agiscono in trans i geni virali possono essere forniti in un virus helper, in un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula “packaging” le sequenze “cis “ sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione

Ciclo vitale di un retrovirus RNA genomico, 2 copie. L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. (Il DNA è anche convertito in forma circolare, che però non sembra essere un intermedio della replicazione). Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. L’apparato della cellula ospite trascive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus Il genoma tipico contiene 3 “geni” gene  regione codificante che dà origine a più di una proteina I tre geni sono gag (componenti del core nucleoproteico) pol (replicazione e ricombinazione) env (componente della membrana esterna) Per l’espressione di pol deve essere ignorato un codone di stop soppressione da parte di un glutamil-tRNA se la fase di lettura è la stessa di gag slittamento del ribosoma se la fase di lettura è diversa da gag L’efficienza del processo è del 5% la quantità di gag prodotta è 20 volte superiore a quella di pol

Vettori retrovirali U3 R U5 U3 R U5 1 Gag-Pol Env 2 3 U3 R U5 U3 R U5 3 Componenti separate U3 R U5 Gene terapeutico U3 R U5 1 p Gag-Pol 2 oppure p Env p VSV-G 3 3 Titoli di 107 unità trasducenti (t.u.)/ml Titoli di 1010 unità trasducenti (t.u.)/ml

Vettori Retrovirali: situazione attuale e prospettive future efficiente trasduzione ex vivo di cellule in attiva replicazione linfociti e precursori delle linee ematopoietiche notevole esperienza clinica ex vivo efficace terapia genica di due bambini affetti da imunodeficienza integra garantendo espressione prolungata, ma a basso livello Contro integrazione random attivazione di oncogeni shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb) Sviluppi futuri: vettori lentivirali

Vettori lentivirali I lentivirus hanno un genoma più complesso oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori. Originariamente derivati da HIV-1 per trasdurre linfociti “pseudotipizzazione” con VSV-G espande il trofismo vettori “pseudotipizzati” con VSV-G possono essere somministrati direttamente in vivo efficiente trasduzione di neuroni e cellule della glia del sistema nervoso centrale di roditori e primati Vettori ibridi derivati da lentivirus non umani (SIV, FIV) virus originale non infettivo per gli esseri umani la reale efficacia in vivo deve essere ancora dimostrata

Vettori lentivirali Trasporto attivo del complesso di pre-integrazione attraverso i pori nucleari possibilità di trasdurre anche cellule quiescenti efficaci nel trasdurre cellule quiescenti ex vivo trasduzione diretta in vivo potrebbe soffrire di alcune limitazioni barriere tissutali nel caso della mucosa resporatoria condizione intracellulare (necessità di replicazione) nel caso degli epatociti devono ancora essere definiti il potenziale reale ed i limiti della trasduzione diretta in vivo mediata da vettori lentivirali Limite comune a vettori retro- e lentivirali la fase a RNA obbligatoria nel ciclo vitale impone determinati limiti nella cassetta di espressione, tra cui la mancanza di introni e di segnali di poliadenilazione.

Virus Adeno Associati (AAV) Parvovirus, inizialmente scoperti come contaminanti di preparazioni di Adeno, richiedono la presenza di un virus helper (per esempio, Adenovirus) per l’infezione produttiva ad oggi sono stati caratterizzati 6 sierotipi la maggior parte deli studi si è concentrata su AAV-2 Ad oggi non sono stati associati a nessuna patologia caratteristica ideale per derivare un vettore di terapia genica Il genoma del virus naturale integra preferenzialmente in un sito specifico del genoma umano (AAVS1 nel cromosoma 19 q13.3-qter)

Struttura genomica dei Virus Adeno Associati ITR (145 nt) ITR Rep Cap Integrazione Incapsidazione Rescue Replicazione del DNA Integrazione Rescue Proteine del capside: VP1, VP2, VP3

Ciclo vitale dei Virus Adeno Associati Fase di latenza Fase litica Ad Rescue Ad Integrazione sito-specifica Replicazione

Vettori AAV: struttura e produzione ITR (145 nt) ITR Promotore-Transgene (max 4.5 kb) 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap 2) Adenovirus helper oppure 2bis) Plasmide esprimente i geni di Adenovirus con funzione helper

Vettori AAV: situazione attuale e prospettive future efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva replicazione espressione prolungata del transgene descritte sia forme episomali che integrate bassa immunogenicità Contro la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo relativamente basso e contaminate da virus Sviluppi futuri: miglioramento dei sistemi di produzione aumento dell’efficienza di integrazione sito-specifica