Fenotipo??? mutante T-DNA Gene Funzione REVERSE PCR-screening

La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato l’approccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Infatti, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene d’interesse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa (reverse genetics).

Strategie di screening per reverse genetics Random Sequencing Strategy: Analisi di banche dati di FST (Flanking Sequence Tags) Pooling Strategy e Screening per PCR

48 linee indipendenti /pool (72 inserzioni T-DNA ) Collezione di mutanti inserzionali Pool 1 Pool 8 48 x 8 384 linee (576 inserzioni T- DNA ) Super Pool A.1 Pool A.2 Hyper Pool A1.2 768 linee (1152 inserzioni T-DNA ) A1.1 50,000 linee (75,000 inserzioni) > 95% saturazione MegaPool 1536 linee (2304 inserzioni T-DNA )

Protocollo di Screening Qualità dei primers: specificità-sensibilità background con i primers T-DNA Screening per PCR di n HP: combinazione di un primer gene-specifico (F/R) ed un primer T-DNA (RB/LB) Analisi per ibridazione (transfer “sandwich”): sonda T-DNA (RB+LB) sonda gene-specifica Segnali coincidenti con le 2 sonde: PCR di conferma con primers T-DNA nested o con primers gene-specifici sequenza del frammento amplificato

Scelta dei Primers gene-specifici T-DNA 5’ 3’ T-DNA T-DNA

Analisi fenotipica La base di qualunque strategia di mutagenesi è l’analisi fenotipica. Dopo aver effettuato la mutagenesi numerosi geni risulteranno mutati. Forse alcuni geni, per caso, non avranno subito alcuna mutazione, mentre in altri casi si potrebbero ottenere mutanti, con diversi livelli di perdita di funzione. Poichè le mutazioni sono di solito recessive, il primo passo consiste sempre in un’autofecondazione e nel passaggio alla T2. Qualora fossero presenti alleli mutati, un quarto di essi nella progenie risulterà omozigote e potrà manifestare nelle condizioni appropriate un fenotipo rispetto al wt. In alcuni casi però la mutazione è sterile o addiritura letale; in questi casi la si propaga allo stato eterozigote. Per identificare i fenotipi mutanti si effettua uno “screening”, in diverse condizioni di crescita. In alcuni casi le mutazioni sono facilmente visualizzabili anche a livello macroscopico. In altri casi, invece le mutazioni sono criptiche e si può cercare di evidenziare un fenotipo facendo crescere le piante in condizioni particolari.

Isolamento di mutanti inserzionali Un esempio: Isolamento di mutanti inserzionali in geni appartenenti alla famiglia Dof

(DNA binding with One Finger) PROTEINE DOF (DNA binding with One Finger) Fattori trascrizionali specifici del regno vegetale Caratterizzate da un singolo motivo “zinc finger” CX2C-X21-CX2C Il dominio Dof presenta un’identità aminoacidica del 70-100% Generalmente non presentano grosse omologie al di fuori del dominio conservato

1 [ . . . . : .] 61 1 DOF15_67_125 LNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNVPVGGSSRKNKRSSSS-- 2 DAG1_74_132 VNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNVPVGGSSRKNKRSSTP-- 3 DOF8_53_111 VNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNIPVGGGSRKNKRSHSS-- 4 DOF24_35_93 LNCPRCNSLNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKDCRRYWTAGGSLRNIPVGGGVRKNKRSSSN-- 5 DOF10_349_407 RNCPRCNSSNTKFCYYNNYSLAQPRYLCKSCRRYWTEGGSLRNVPVGGGSRKNKKLPFP-- 6 DOF23_35_93 LRCPRCDSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKSCRRYWTKGGTLRNIPVGGGCRKNKRSTSS-- 7 DOF6_40_98 LRCPRCDSTNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKSCRRYWTKGGILRNIPIGGAYRKHKRSSSA-- 8 DOF11_73_131 QKCPRCESTHTKFCYYNNYSLSQPRYFCKTCRRYWTKGGTLRNIPVGGGCRKNKKPSSS-- 9 DOF20_19_77 QNCPRCESPNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKSCRRYWTKGGTLRNVPVGGGCRRNKRSSSS-- 10 DOF28_25_83 PSCPRCGSSNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTKGGSLRNVPVGGGCRKSRRPKSS-- 11 DOF31_38_96 PACPRCASSNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKGCRRYWTKGGSLRNIPVGGGCRKRSRSRQN-- 12 HPPBF-2a_110_168 LPCPRCKSMETKFCYYNNYNINQPRHFCKACQRYWTAGGTMRNVPVGAGRRKNKSSSSH-- 13 DOF12_152_210 LPCPRCNSMETKFCYYNNYNVNQPRHFCKKCQRYWTAGGTMRNVPVGAGRRKNKSPASH-- 14 DOF13_54_112 LPCPRCNSMETKFCYYNNYNVNQPRHFCKACQRYWTSGGTMRSVPIGAGRRKNKNNSPT-- 15 HPPBF-2b_132_190 IPCPRCESANTKFCYYNNYNVNQPRYFCRNCQRYWTAGGSMRNVPVGSGRRKNKGWPSS-- 16 DOF16_56_114 LPCPRCNSADTKFCYYNNYNVNQPRHFCRKCQRYWTAGGSMRIVPVGSGRRKNKGWVSS-- 17 DOF29_62_120 IPCPRCKSMETKFCYFNNYNVNQPRHFCKGCQRYWTAGGALRNVPVGAGRRKSKPPGRV-- 18 DOF9_58_116 IACPRCKSMETKFCYFNNYNVNQPRHFCKGCHRYWTAGGALRNVPVGAGRRKSKPPGRV-- 19 DOF17_32_90 LSCPRCESTNTKFCYYNNYNFSQPRHFCKSCRRYWTHGGTLRDIPVGGVSRKSS-KRSRT- 20 OBF_1_30 ----------------------------ACRRYWTHGGTLRDVPVGGGTRKSA-KRSRT- 21 DOF18_29_87 LPCPRCNSTTTKFCYYNNYNLAQPRYYCKSCRRYWTQGGTLRDVPVGGGTRRSSSKRHR-- 22 DOF32_95_153 LKCPRCDSTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKACRRYWTRGGALRSVPVGGGCRRNKRTKNS-- 23 DOF7_89_147 LKCPRCESTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKTCRRYWTRGGALRNVPVGGGCRRNRRTKSN-- 24 DOF5_94_152 LKCPRCDSANTKFCYFNNYNLTQPRHFCKACRRYWTRGGALRNVPVGGGCRRNKKGKSG-- 25 DOF4_60_118 LNCPRCDSTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKTCRRYWTRGGSLRNVPVGGGFRRNKRSKSR-- 26 DOF22_17_75 LKCPRCDSSNTKFCYYNNYNLTQPRHFCKGCRRYWTQGGALRNVPVGGGCRRNNKKGKN-- 27 DOF2_29_87 LKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKSCRRYWTKGGALRNVPVGGGSRKNATKRST-- 28 DOF1_33_91 LKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKNCRRYWTKGGALRNIPVGGGTRK-SNKRSGS- 29 DOF3_50_108 LKCPRCNSLNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKNCRRYWTKGGVLRNVPVGGRSRK--AKRSKTK 30 DOF21_41_99 LKCPRCNSPNTKFCYYNNYSLSQPRHFCKSCRRYWTRGGALRNVPIGGGCRK--TKKSIKP 31 DOF19_40_99 LKCPRCDSVNTKFCYYNNYSLSQPRHYCKNCRRYWTRGGALRNVPIG-GSTRNKNKPCSLQ 32 DOF30_27_85 LKCPRCDSSNTKFCYYNNYSLSQPRHFCKACKRYWTRESEFLSSGFSSLSALGLGLPHQ-- 33 DOF27_24_82 RVCPRCDSDNTKFCFYNNYSESQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNIPVGGSCRKPKRLKVD-- 34 DOF25_21_79 RVCPRCYSDQTRFSYFNNNKKSQPRYKCKNCCRCWTHGGVLRNIPVTGICDKSNLPKID-- 35 DOF26_25_83 RVCARCDSDNTKFCYYNNYSEFQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNVPIGGSS-RAKRTRINQ- 36 DOF14_25_83 RVCARCDSDNTKFCYYNNYCEFQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNIPIGGSS-RAKRARVNQ- consensus/70% l.CPRCsSsNTKFCYYNNYslsQPRaFCKsCRRYWTcGGsLRNlPVGGGsR+spp.pss

Isolamento del mutante inserzionale nel gene Dof DAG1 T-DNA +1 ATG 5'UTR Dof 3'UTR PCR su 29 HPs con le 2 coppie di primers Analisi su gel dei prodotti di PCR Blotting a “sandwich” Ibridazione sia con la sonda DAG1 che con la sonda T-DNA

+ Sonda DAG1 Sonda T-DNA