XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI Relazione II anno Dottoranda: Stefania Luppi Tutore: Prof. Giuseppe Ricci 30 Settembre 2009

Analisi della FAGOCITOSI di SPERMATOZOI nello studio dell’INFERTILITA’: messa a punto di una metodica citometrica 2. Effetti della LEUCOCITOSPERMIA sull’outcome delle tecniche di fecondazione in vitro (ICSI/FIVET)

SCOPO: TEST DIAGNOSTICO 1. Analisi della FAGOCITOSI di SPERMATOZOI nell’INFERTILITA’: messa a punto di una metodica citometrica 15% coppie infertili in Paesi Occidentali  15% infertilità idiopatica IPOTESI: ANOMALA RIMOZIONE DEGLI SPZ DA PARTE DEL SIST. IMM. FEMMINILE CAPACITAZIONE spz: dai 50 min alle 4 ore Spz POST-CAPACITATI eliminati per fagocitosi da parte dei macrofagi uterini suscettibilità spz ad essere fagocitati in INFERTILITA’ IDIOPATICA SCOPO: TEST DIAGNOSTICO In grado di misurare la fagocitosi di spz da parte di cellule fagocitarie

TEST DIAGNOSTICO THP1 SPERMATOZOI FACS 1. SPERMIOGRAMMA Spz non colorati Spz non cap pHrodo Spz cap pHrodo Phrodo THP1 1. SPERMIOGRAMMA 2. CAPACITAZIONE in vitro (Swim-Up): recupero di spz vitali e con buona motilità 3. FAGOCITOSI (non capacitato t0; capacitato SUt0; post-capacitato SUt24)

RISULTATI: esempio Non colorati pHRodo NON CAPACITATO t0 1. Analisi della FAGOCITOSI di SPERMATOZOI nell’INFERTILITA’: messa a punto di una metodica citometrica RISULTATI: esempio Non colorati pHRodo 10 1 2 3 200 400 600 800 1000 0,32 SSC - Height 0,51 NON CAPACITATO t0 maggior variabilità cellulare CAPACITATO SUt0: migliori condizioni del campione POST-CAPACITATO SUt24: aumento degli spz non funzionali

RISULTATI > Fagocitosi se parametri liquido seminale sono alterati 1. Analisi della FAGOCITOSI di SPERMATOZOI nell’INFERTILITA’: messa a punto di una metodica citometrica RISULTATI p<0,05 p<0,05 Studio effettuato su 14 pazienti NON-NORMOZOOSPERMICI p=0,035 > Fagocitosi se parametri liquido seminale sono alterati

WHO, 1992: LEUCOCITOSPERMIA = leucociti perossidasi+ > 1x106/ml 2. Effetti della LEUCOCITOSPERMIA sull’outcome delle tecniche di fecondazione in vitro (ICSI/FIVET) Alte concentrazioni di LEUCOCITI nel liquido seminale associate a: bassa qualità liquido seminale < tasso di fertilizzazione e gravidanze dopo tecniche IVF WHO, 1992: LEUCOCITOSPERMIA = leucociti perossidasi+ > 1x106/ml CITOMETRIA A FLUSSO + Ab mono -CD45 Metodo semplice, riproducibile Conta PRECISA Distingue SOTTOTIPI leucociti Ricci et al., 2000 Tecnica NON precisa Non adatta per basse conc WBC Identifica solo PMN TEST PEROSSIDASI ! Influenza LEUCOCITOSPERMIA su: alcuni parametri del liquido seminale tassi di fertilizzazione degli ovociti e di sviluppo degli embrioni tassi di gravidanze SCOPO:

RISULTATI: esempio LEUCOSPERMICO Leuco >1x106/ml NON-LEUCOSPERMICO 2. Effetti della LEUCOCITOSPERMIA sull’outcome delle tecniche di fecondazione in vitro (ICSI/FIVET) RISULTATI: esempio linfociti monociti PMN LEUCOSPERMICO Leuco >1x106/ml NON-LEUCOSPERMICO Leuco <1x106/ml Studio effettuato su 20 pazienti rivoltisi al centro PMA del Burlo (3 leuco, 17 non-leuco). Necessari altri campioni per effettuare analisi statistiche adeguate.

PROSPETTIVE FUTURE: Test citometrico valido per valutare differenze di suscettibilità alla fagocitosi in singoli campioni di liquido seminale. Per confermare l’ipotesi che esistono soggetti infertili per la presenza di spermatozoi maggiormente vulnerabili alla fagocitosi: VALUTARE I LIVELLI DI FAGOCITOSI DI UN MAGGIOR NUMERO DI LIQUIDI SEMINALI DI SOGGETTI INFERTILI E FERTILI. Per valutare gli effetti della leucocitospermia sui parametri del liquido seminale e sull’outcome delle tecniche di fecondazione in vitro è necessario: AUMENTARE LA CASISTICA, VALUTANDO LA QUANTITA’ DI LEUCOCITI IN UN MAGGIOR NUMERO DI CAMPIONI DI LIQUIDO SEMINALE DI PAZIENTI CHE SI SOTTOPONGONO A ICSI E FIVET.