Dott.ssa Katouzian Forough 12 Dicembre 2005 VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA’ INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 12 Dicembre 2005

Introduzion La permeabilità intestinale viene solitamente studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri. Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati dall’organismo. Il lattulosio è un disaccaride di PM 342.3 viene assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM 182.17 e viene assorbito per via transcellulare

Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al ramnosio Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn) Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLC

SCOPO DELLA RICERCA Semplificare lo studio della permeabilità intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio. Valutare l’azione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nell’assorbimento dei due zuccheri. Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50µl) utilizzando la tecnica di HPLC.

ATTIVITA’ SVOLTA Determinazione della minima dose efficace, sulla permeabilità epiteliale di un nuovo modulatore della via paracellulare (esapeptide sintetico). Studio della sua cinetica d’azione Verificare la cinetica del transito di macromolecole attraverso la mucosa intestinale resa permeabile dalla molecola sopra descritta.

V.Cholerae cleavage site Esapeptide sintetico : NH2-FCIGRL-COOH presente in Zot. V.Cholerae cleavage site msifihhgap gsyktsgalw lrllpaiksg rhiitnvrgl nlermakylk mdvsdisief idtdhpdgrl tmarfwhwar kdaflfidec griwpprlta tnlkaldtpp dlvaedrpes 121 fevafdmhrh hgwdiclttp niakvhnmir eaaeigyrhf nratvglgak ftltthdaan 181 sgqmdshalt rqvkkipspi fkmyastttg kardtmagta lwkdrkilfl fgmvflmfsy 241 sfyglhdnpi f tggndatie seq sepqska tagnavgska vapasfg fcigrl cvqdgfv 301 tvgderyrlv dnldipyrgl watghhiykd kltvffetes gsvptelfas syrykvlplp 361 dfnhfvvfdt faaqalwvev krglpikten dkkglnsif 12 KDa c-terminal fragment (ΔG)

DETERMINAZIONE DELLA MINIMA DOSE EFFICACE ad ogni topo è stata somministrata 100µl di soluzione contenente 12mg Lact e 8mg Rh (Clin.Chim.Acta 2005,352, 191) no mice esapeptide L/R 3 - 0.048±0.001 3 25 μg 0.052±0.002 3 100 μg 0.060±0.0015 3 250 μg 0.169±0.0019

chromatogramma di minma dose efficace Black line: standard Lactulose Orange line: standard L-Rhamnose Violet line:serum of m. treated with 250 Blu line: serum of m. treated with 100 Rh lact

RESULTS 2. BIOLOGICAL ACTIVITY OF 1: FCIGRL, 2: GRLFCI, 3: FMIGRL, 4: GGVLVQPG DURING 24 h. AFTER ORAL ADMINISTRATION OF SINGLE DOSE (250 μg) IN 6 GROUPS (2 animals/group) OF MICE. P+S S S S S S Blood sample 1 6 7 9 10 12 13 15 16 24 25 h. Sinthetic peptides Lactulose/Rhamnose ratio results 1: 0.156 0.159 0.165 0.10 0.09 0.059 2: 0.060 0.051 0.065 0.06 0.059 0.068 3. 0.050 0.047 0.050 0.049 ND ND 4. 0.03 0.040 0. 039 ND ND 0.065

Chromatogram of analysis of serum in the presence of exapeptide at1h and 7h after administration of sugars. The black line: after 1h The green line: after7h. Rh lact

Chromatogram of analysis of serum in the presence of exapeptide and scrambled at1h and after administration of sugars black line:exapeptide after 1h green line: scrambled after 1h Rh lact

Chromatogram of analysis of serum in the presence of exapeptide at1h and 24h after administration of sugars The black line after 1h the pink line after16h. Rh lact

CONCLUSIONE Esapeptide altera la permeabilità intestinale. Questo effetto è immediato a dose efficace (250µg) ed è reverssibile entro 16h. La reversibilità dell’azione dimostra che la mucosa intestinale non viene danneggiata. La prolungata attivita sulla via paracellulare e la conseguente alterata permeabilità offre la reale possibilità di trasferire macremolecole o farmaci, incapaci di attraversare la bariera intestinale,nel circolo sistemico.