L’intolleranza al glutine Alberto Tommasini, Laboratorio Immunologia Pediatrica, IRCCS Burlo Garofolo tommasini@burlo.trieste.it

Samuel Gee, 1888

Che cosa è la celiachia Enteropatia da causa alimentare Malassorbimento Difetto di crescita Possibili concause infettive Crisi celiaca

Enteropatia da causa alimentare Quali alimenti ? Enteropatia da causa alimentare Trattamento dietetico: dall’inizio del ‘900 diete ipersemplificate 1908 Herter: I grassi sono tollerati meglio dei carboidrati 1924 Haas: Dieta povera in carboidrati ad eccezione di quelli contenuti nelle banane (che consentono di tollerare bene I grassi). - anni ‘30: esclusione di tutti i farinacei - anni ‘40: solo i derivati del frumento

Quale parte del frumento ? Intolleranza al glutine Glue = colla + glutine + intrappolamento di aria durante la lievitazione

Dove si trova il glutine ? frumento orzo avena farro segale

Alimenti privi di glutine Dove non si trova il glutine ? alimenti privi di glutine Alimenti privi di glutine , Mais, Legumi www.farmacialoreto.it/

Enteropatia Effetto tossico del glutine sui villi intestinali Villi normali (enorme superficie di assorbimento) Atrofia dei villi

Malassorbimento 200 anni Intestino tenue Tratto prossimale ferro, calcio, lipidi vitamine idrosolubili Digiuno carboidrati e aminoacidi Tratto distale acidi bilari e vitamina B12 Determinante è l’azione del colon per l’assorbimento di acqua ed elettroliti

Alimenti privi di glutine Malassorbimento Alimenti privi di glutine Mancanza di nutrienti: dimagrimento, distrofia, difetto di crescita Mancanza di vitamine e microelementi anemia sideropenica osteopenia /osteoporosi Passaggio di cibo non digerito nel colon Metabolismo batterico, meteorismo presenza di grasso nelle feci

La diagnosi Con glutine Senza glutine Con glutine

Valutati gli effetti di peptidi sintetici sintetici di gliadina in diversi modelli in vitro (intestino di pollo, fegato di ratto). Peptide candidato: residui 75-86 dell’ a-gliadina RPQQPYPQPQPQ Studi di tossicità Produzione di INF-g da sangue di celiaco stimolato con I singoli peptidi Infusione intraduodenale dei petidi in soggetti celiaci

HLA e CELIACHIA L’85 % dei celiaci ha l’HLA DQ2, il 10% il DQ8: Associazione di linkage o ruolo patogenetico dell’HLA? HLA e CELIACHIA b1 0201 a1 0501

peptide HLA e glutine

Cloni T, HLA, glutine Biopsia di soggetti celiaci in GFD incubate per 18 h con digesto peptico-triptico di gliadina isolamento di cellule CD25+ e allestimento di linee e cloni T misura della risposta proliferativa specifica al glutine inibizione dell’attivazione con anticorpi anti-specifici HLA T riconoscono il glutine in maniera ristretta dal DQ2 Cloni T, HLA, glutine

Cause e meccanismi risposta immune: infezione da glutine Anticorpi anti-glutine (AGA) Linfociti T anti glutine produttori di INFgamma Risposta simile a quella verso un agente infettivo continuamente somministrato

Risposta al glutine ed enteropatia

T DQ2 anti gliadina Tetrameri HLA e Tetrameri costruiti in baculovirus con peptide covalentemente legato coniugati con strepatvidina R-PE peptidi a-1 a-2 e g-1 T DQ2 anti gliadina Tetrameri HLA e Streptavidina-RPE Peptide HLA

come monoclonali Tetrameri HLA ANALISI CITOMETRICA SU SANGUE PERIFERICO CON TETRAMERI-PE CON PEPTIDE g-1-DQ a-1-DQ 2 a-2-DQ Tetramero-PE come monoclonali Tetrameri HLA Limiti: la colorazione diminuisce fortemente dopo stimolo specifico, a causa di una downregolazione del TCR

Quanto è frequente Rara 1:1000/ 1:10000 Quadro clinico: ben caratterizzato; enteropatia glutine-dipendente Patogenesi: non compresa Diagnosi: lungo iter; 3 biopsie “Celiachia” Prevenzione: ritardare l’introduzione del glutine.

LA nuova celiachia IL PRESENTE Non sempre l’enteropatia è evidente Anemia isolata Osteopenia isolata Altre manifestazioni più “distanti” Dermatite erpetiforme Malattie autoimmuni (diabete, tiroidite …)

Cause e meccanismi Dagli EMA all’autoimmunità Dagli anni ’80 l’associazione con malattie autoimmuni aveva spinto alla ricerca di marcatori autoimmuni Gli anticorpi anti endomisio (EMA) Capire la patogenesi dell’autoimmunità celiaca ? Migliorare la diagnostica sierologica della malattia ! Qual è l’auto-antigene responsabile ?

Cause e meccanismi La transglutaminasi tessutale Come ci si è arrivati - Un enzima importante Che c’entra con il glutine e la celiachia?

Ruolo della transglutaminasi Cause e meccanismi Ruolo della transglutaminasi JEM 2000

Che cosa c’entra la’utoimmunità? Gli Ac anti endomisio epifenomeno? trascinamento? patogenetici?

Il modello celiachia Alterata immunità - ambiente

Il modello celiachia Alterata immunità - ambiente

Quanto è frequente IL PRESENTE Frequente 1:100/1:250 (testing, screening) Quadro clinico: polimorfo; enteropatia NON necessaria silente/latente/potenziale G.I. = “casi atipici” Patogenesi: alterata risposta immune geneticamente determinata. Diagnosi: semplificata; autoanticorpi (EMA, htTG) 1 (o NO?) biopsia. “Genetic gluten Intolerance” Prevenzione: glutine “tanto e subito” Screening di massa?

Ambiente e rischio di diabete Quanto pesa l’ambiente ? Ci sono fattori ambientali identificabili ? Come interagiscono con l’individuo ? E’ possibile operare una prevenzione ?

Fattori ambientali ipotizzati: Infezioni da enterovirus (Carratù ‘99, Hiltunen ‘97) Latte vaccino (Kolb ‘99) Glutine (SIGEP ‘99) Inoltre l’associazione tra intolleranza al glutine e diabete è nota da diverso tempo

Il latte vaccino e l’uomo Uomo nomade e cacciatore Non alleva vacche A volte ottiene latte da capre 1600: allevamenti di vacche da latte breve tempo per selezione negativa

Infiammazione glutine dipendente della mucosa intestinale e rischio di diabete 7% 6,2% 6% 4,7% 5% 3,5% 4% 3% 2% 0,8% 1% 0% Celiaci <2 2-10 >10

L’ intestino nel diabete Permeabilità della mucosa intestinale Infiammazione: aumento di linfociti nella mucosa

Studio con librerie anticorpali Il modello celiachia Studio con librerie anticorpali CK CH1 VK VH scFv C-DNA Ag Amplificare l’mRNA che codifica le regioni variabili delle Ig. 2) Clonare i c-DNA in vettori fagici. 3) Selezione dei fagi che riconoscono la tTG. scFv gene3 Tag VK VH Ciclo fagico Antigene Lavaggio C-DNA

Studio con librerie anticorpali Il modello celiachia Studio con librerie anticorpali Gli anti TTG nel celiaco sono prodotti solo e soltanto dai linfociti della mucosa intestinale (Marzari et al. J. Immunol, 2001). “Epitope mapping” ovvero esiste una specificita’ epitopica degli anti TTG nel celiaco (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001 ). Anche altri autoanticorpi, quando presenti nel celiaco, sono prodotti dai linfociti della mucosa intestinale ( Boscolo S. et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001). La produzione di autoanticorpi da parte dei linfociti intestinali prescinde dalla presenza e dalla gravita’ della lesione istologica e puo’ NON essere rilevabile nel siero (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 ).

PBL library IBL library Il modello celiachia Epitope mapping Atassia da glutine IBL library

- Induzione di tolleranza peptidasi batteriche riso transgenico? Come si può curare DALLA CONOSCENZA DEI PEPTIDI TOSSICI A NUOVE TERAPIE - Induzione di tolleranza peptidasi batteriche riso transgenico?

Come si può curare Peptidasi Il peptide tossico di 33 aa, che viene deaminato dalla transglutaminasi e riconosciuto dall’HLA DQ2, potrebbe essere specificamente scisso da peptidasi batteriche che potrebbero essere utilizzate per pretrattare il cibo

Come si può curare Peptidasi Digestione inefficace dei peptidi tossici da parte degli enzimi del brush border intestinale Efficace completamento della Digestione con Prolyl endopeptidasi batterica

STRATEGIE ADOTTATE PER “DETOSSIFICARE” IL FRUMENTO Come si può curare Riso transgenico STRATEGIE ADOTTATE PER “DETOSSIFICARE” IL FRUMENTO Breeding e selezione di linee di frumento a basso contenuto in gliadine Modificazioni per eliminare le sequenze antigeniche PROBLEMATICHE Elevato numero di geni distribuiti su 42 cromosomi Elevata variabilità genetica Diffusione di varietà coltivate

Utilizzare un cereale non allergenico Come si può curare Riso transgenico STRATEGIA Utilizzare un cereale non allergenico Oryza sativa Migliorare le proprietà tecnologiche introducendo le sequenze gluteniniche con le migliori caratteristiche reologiche

Che cosa è la celiachia Perché tanto glutine 200 anni Glutine 30% Glutine 2% Infezioni DQ2/DQ8