MicroRNA and Lung Cancer CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Journal Club MicroRNA and Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA and Lung Cancer CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia New Engl J Med 2005; June 9; 23:2446-2448 MicroRNA and Lung Cancer Matthias Eder, Michaela Scherr Università di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA and Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia RAS e tumore polmonare microRNA: definizione e funzione Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA and Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia RAS e tumore polmonare microRNA: definizione e funzione Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia

LA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA Mutazioni puntiformi Amplificazione genica Traslocazioni cromosomiche delezioni ONCOGENE: carattere dominante ONCOSOPPRESSORE: carattere recessivo Oncogeni On Oncosoppressori On Oncogeni Off Off Oncosoppressori

Chronology of genetic and molecular lesions Normal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC Carcinoma 3p- 9p- 17p- Aneuploidy P53 mut Ras mut Telomerase + FHIT Rb C.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44s

MAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCER Clinics in chest medicine, march 2002 vol.23; n1:83 SCLC (%) NSCLC (%) Proto-oncogenes and growth stimulation Putative autocrine loops GRP/GRP receptor HGF/MET SCF/KIT NDF/ERBB RAS mutation <1 15-20 MYC amplification 15-30 5-10 Other molecular changes BCL-2 expression 75-95 10-35 Telomerase activity 100 80-85

Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000 RAS Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo legano GTP e allo stato inattivo legano GDP Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 ) nel ritorno allo stato di quiescenza della proteina Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del polmone La mutazione è correlata all’abitudine tabagica ras Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000

+ + MUTAZIONE DI KRAS GTP GDP GTP GDP GAP GAP Mutant KRAS active Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83 Drugs that inhibit mutant KRAS expression or function Drugs that block specific downstream signals Mutant KRAS active Inactive KRAS GTP active KRAS GAP Inactive KRAS + GDP GAP GTP + GDP Downstream signal transduction cascade

Ras e stimoli proliferativi Cellular Signalling 2000; 12: 425-434 Integrine GPCR a PDGFR EGFR IL-2R b Ras AF-6 RGL PI3K Raf Rin1 Mekk Nore1 MAPK Gap Junctions PLD Akt BCR JNK ? Effetti biologici

Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234 RAS Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi polmonari Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia polmonare NSCLC la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento con gefitinib Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234

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Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA Piccoli frammenti di RNA (lunghezza 21-25 nucleotidi) non codificanti Regolazione negativa della trascrizione genica mediante ibridazione a sequenze complementari nella regione 3’ (3’UTR) del mRNA target Meccanismo simile nelle piante e negli animali Alcuni miRNA sono alterati nelle neoplasie Università di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA: sintesi Nature 2005;435:745-746 RISC: RNA-induced silencing complex

Interazione tra microRNA e mRNA target Journal of Cell Biology 2002; 156:17-21 Università di Modena e Reggio Emilia

Inibizione della trascrizione proteica Funzione dei microRNA RISC 3’ UTR mRNA 3’ UTR mRNA microRNA RISC microRNA Clivaggio dell’mRNA Inibizione della trascrizione proteica Cell 2004; 116:281-297

Fig. 1. Correlation between FRAs and miRs Sito fragile:regione cromosomica soggetta a rottura spontanea o indotta Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004 Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences

Fig. 3. MiRs as cancer players Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004 Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences

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Università di Modena e Reggio Emilia Let-7 lethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNA La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo cellulare comportando divisione delle cellule in modelli sperimentali Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per let-7 che mappano regioni delete nelle neoplasie la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee cellulari di tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia

microRNA e tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia

microRNA e tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia

Analisi della espressione di let-7 nel tumore polmonare Northen blot in linee cellulari di neoplasie polmonari HNLEC = human normal lung epithelial cell lines 20 linee cellulari di neoplasia polmonare 5S rRNA = controllo Northen blot in neoplasie polmonari in vivo Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756

Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7 Real-Time Reverse Transcription-PCR Hierarchical Clustering 143 NSCLC cDNA primer 105 adk cDNA primer Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756

microRNA e tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia

LA PRESENZA DI let-7 INFLUENZA LA ESPRESSIONE DI RAS Controllo negativo Cellule HepG2 trasfettate con let-7 Quantificazione della immunofluorescenza di RAS Controllo negativo Cellule HeLa let-7 + transfettate con oligonucleotidi antisenso inibenti Quantificazione della immunofluorescenza di RAS

let-7 E’ SCARSAMENTE ESPRESSO NEL TUMORE POLMONARE 20 neoplasie:polmone, colon,mammella NAT: normal adjacent tissue Northen blot 3 Ca squamocellulari Università di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans Figure 1. MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans. In specific vulval precursor cells from worms (Panel A) and in normal human lung tissue (Panel B), mir-84, a member of the let-7 microRNA family, and let-7, respectively, are transcribed, and the transcripts, which have characteristic hairpin structures, are processed into mature microRNAs. These are then incorporated into a silencing complex (called miRISC). MicroRNA species guide miRISC to target mRNAs by hybridizing to complementary sequences in the 3'UTRs of the mRNAs and thereby prevent their translation. A recent study by Johnson and colleagues1 showed that members of the let-7 family repress the expression of RAS genes and that this mechanism is potentially relevant to the pathogenesis of lung cancer (Panel C). The question marks in Panel C indicate that the reduced expression of let-7 microRNA in lung cancer may be due to alterations in transcription, processing, or maturation. The abrogation of translational repression results in the overexpression of RAS proteins in lung-cancer cells. Additional details of the mechanism by which microRNA represses gene expression are available elsewhere.2 ORF denotes open reading frame. Eder, M. et al. N Engl J Med 2005;352:2446-2448

MicroRNA and Lung Cancer: Università di Modena e Reggio Emilia Conclusioni MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della espressione proteica let-7 è in grado di inibire la trascrizione di RAS Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di let-7 L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e ad un peggioramento della prognosi nel tumore polmonare Possibilità di terapia genica in futuro? Università di Modena e Reggio Emilia

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RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA ATTIVAZIONE DI RAS CAAX CAAX Proteolysis (Rce-1) RAS RAS Isoprenyl group c AAX RAS PTI Competitive inhibitor of prenyltransferase P-P Prenyltransferase + isoprenyl-pyrophosphate K RAS N RAS H RAS COCH3 COCH3 COCH3 Lys lys Cell Membrane CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003