PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus) Insetti vivi (sistema di espressione: virus patogeni specifici) Cellule di mammifero in coltura Animali vivi come bioreattori (pharming)

INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI Transgenesi: tecnologia del trasferimento genico per introdurre sequenze di DNA nel genoma di cellule animali (o vegetali) - Creazione di linee cellulari transgeniche Creazione di animali transgenici (contengono il gene clonato in tutte le loro cellule) Scopi: Produzione di proteine ricombinanti a scopo farmacologico (anche da animali vivi: pharming) Creazione di modelli animali per malattie umane - Ingegnerizzazione di cellule umane per la terapia genica in vivo o ex vivo

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE DI MAMMIFERO 1) Trasferimento genico diretto: trasfezione mediata da liposomi trasfezione mediata da recettori trasfezione DNA libero con microiniezione nel nucleo 2) Trasferimento tramite vettori - plasmidici virali (trasduzione) 3) Tipi di Inserzione: ectopica mirata 4) Obiettivi: Produzione di proteine e farmaci Inserzione geni in cellule specifiche per creazione animali transgenici Terapia genica somatica nell’uomo

Trasferimento genico diretto Trasfezione (per endocitosi) mediata da liposomi anionici o cationici Analogo sintetico del doppio strato fosfolipidico di membrana DNA trasportato nell’interno DNA trasportato all’esterno 4

Trasferimento genico diretto Trasfezione (per endocitosi) mediata da recettori Esempio:utilizzo recettore TfR

Trasferimento genico diretto Trasfezione DNA libero con microiniezione Inserzione di più copie di DNA lineare

Trasferimento genico tramite vettori virali Virus a DNA o ad RNA Obiettivo Introdurre e pilotare l’espressione di transgeni in cellule in coltura Espressione Transitoria per transgeni non integrati nel genoma ospite, elevata espressione ma necessario trattamento ripetuto Stabile ma ridotta per transgeni integrati Svantaggi Possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

Trasferimento genico tramite vettori virali Sistema vettoriale Ospite e localizzazione Considerazioni SV40 Vari mammiferi può o meno integrarsi Adenovirus (virus raffreddore) Vari mammiferi, di solito episomico Inserto fino a 8 kb, elevato livello espressione Virus adeno-associati Vari mammiferi, si integra siti specifici cromosoma 19 Inserto fino a 4,5 kb, necessita di adenovirus per packaging Papillomavirus (cancro del collo uterino) Vari mammiferi, integrazione stabile Inserzione DNA di buone dimensioni Elevato livello espressione Retrovirus Ampia gamma, si integra come cDNA Dimensioni fino a 8,5 kb

Trasferimento genico tramite vettori virali Siti di clonaggio Genoma 5,2 kb Promotore costitutivo forte Eliminazione di alcuni geni virali per inserire DNA esogeno Adatto a molti tipi cellulari Alta efficienza espressione transiente Limitazioni inserto per permettere packaging

Trasferimento genico tramite vettori virali Svantaggi Virus non integrati: espressione transiente Virus integrati: espressione stabile, possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI Produzione proteine umane in grandi quantità sostituisce la purificazione da: - organi o tessuti animali di proteine animali a volte poco efficaci o con effetti allergici o contaminanti; - organi e tessuti umani (sangue o organi di cadaveri); es. purificazione ormoni della crescita da ipofisi e rischio di malattia Creutzfeld-Jacob Produzione in batteri Produzioni in eucarioti microbici Produzioni in cellule animali vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche svantaggi: colture costose (supporto solido per la crescita, densità minime, uso di vettori virali e possibili conseguenze nella co-purificazione) Produzioni in animali e piante transgenici = pharming (pharmacological e farming)

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE, EUCARIOTICHE O PHARMING PRODOTTO MALATTIA Insulina Diabete Somatostatina Disordini della crescita, acromegalia, nanismo Somatotrofina Fattore VIII Emofilia A Interferone (vari) Leucemia e altri tumori Fattore di crescita epidermide Ulcere Fattore di crescita fibroblasti Eritropoietina Anemia Attivatore tissutale plasminogeno Infarto

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA Molecola piccola non glicosilata, ponti disolfuro Proteina di fusione: pochi aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina Formazione del legame disolfuro inefficiente! Cambiata la sintesi (vedi diapo successiva)

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA Dopo ripiegamento spontaneo Tagli proteolitici eliminano il leader e il segmento C

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOSTATINA Molto piccola: solo 14 aa = 42 bp aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOTROFINA Proteina grande: 191 aa Estrazione di mRNA ipofisario, produzione cDNA, Sito di taglio per HaeIII inserimento leader sintetico, clonaggio, trasformazione, produzione proteina Leader sintetico: codoni 1-24 sostituiti (stessi aa) per corretta traduzione (propensione del codice) in E. coli

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII Produzione in E. coli impossibile 26 esoni e 25 introni 2351 aa Proteina dimerica: subunità A e C con17 legami disolfuro e molti siti glicosilati Necessari 17 legami disolfuro e glicosilazione: tentativi di produzione in E. coli ma proteina non attiva!

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII I 2 cDNA per subunità A e subunità C clonati in 2 vettori di espressione plasmidici separati. Promotore Ag: ibrido sequenza -actina di pollo e -globina di coniglio Plasmidi introdotti in linea cellulare di hamster Produzione efficiente e proteina attiva FVIII prodotto anche tramite pharming (secreta come proteina del latte nel maiale)

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI Sistema Specie Prodotto Latte Maiale Fattore VIII Topo Attivatore plasminogeno tissutale umano Ormone della crescita umana Fibrinogeno umano Coniglio Eritropoietina umana Pecora 1-antitripisina umana Fattore IX Capra Siero (sangue) Urine

CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI 1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula appena fecondata. Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali) 2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto l’animale che ne deriva è trangenico 3) Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogata L’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali hanno il transgene) A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

CLONAGGIO NELLE CELLULE DI MAMMIFERO CON MICROINIEZIONE NEL NUCLEO Trasferimento genico mediante microiniezione nel nucleo (pronucleo maschile) Microiniezione di plasmidi batterici con DNA gene da inserire Microiniezione di copie di DNA lineare (privo di vettore) Inserimento nel DNA cromosomico di copie multiple in tandem Utilizzo: permettono la produzione di animali transgenici quali modello di malattie Svantaggi: Scarsa efficienza di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Stimolazione dell’ovulazione in una femmina Appena dopo l’accoppiamento microiniezione di DNA con il transgene (circa 200 copie) iniettato all’interno del pronucleo maschile (fatto su 20-30 ovuli fecondati) Gli ovuli microiniettati vengono impiantati nell’utero di una madre adottiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane: progenie e analisi. L’animale è transgenico perché il transgene è presente in tutte le cellule

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Oocita fecondato Accoppiate con maschi vasectomizzati

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

LA GHIANDOLA MAMMARIA COME BIOREATTORE - Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore Produce fino a 10g/l di proteina transgenica Una pecora produce 250-280 litri ogni ciclo di lattazione - E’ più economico dei comuni fermentatori - Produce corrette modificazioni post-traduzionali - Facile la purificazione (nel latte ci sono poche proteine) Clonaggio a monte di un promotore espresso nella ghiandola mammaria (caseina, beta-lattoglobulina)

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI Produzione di Fattore VIII umano nel latte del maiale. Il cDNA umano completo a valle del promotore del gene della proteina acida del siero del latte di maiale. Sintesi di fattore VIII nel tessuto mammario del maiale e secrezione della proteina nel latte Problematiche: Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei (in genere non più del 5% degli oociti iniettati dà progenie transgenica. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali Invecchiamento prematuro degli animali Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

Tecnologia del trasferimento nucleare Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo

Tecnologia del trasferimento nucleare Clonazione animale: creazione di Dolly

Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997) Problematiche della clonazione animale: Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare - Alta frequenza di malattie congenite negli animali Invecchiamento prematuro degli animali Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento. Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti NO è una CHIMERA!!! Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellule ES)

Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti Solo alcuni topi produrranno gameti con il transgene che daranno topi transgenici

Efficienza del trasferimento genico Meno del 5% della prole è transgenica Problematiche: Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali Invecchiamento prematuro degli animali Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).