CARATTERISTICHE VETTORE PLASMIDICO DI CLONAGGIO Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici - Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante - Siti multiplo di clonaggio

oppure elettroporazione T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

su terreno con antibiotico Piastramento su terreno con antibiotico T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

Selezione per la presenza del vettore: resistenza ad antibiotico T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

VETTORI DI CLONAGGIO PER E. coli Tipo Dimensioni (kb) Dimensioni inserto (kb) Sistema selezione Metodo introduzione Plasmidi pBR322 4,3  6 2 Antibiotici Trasformazione pUC 2,1 8 Amp + Lac Z Trasformazione Batteriofago lambda 25 20-25 Infezione Fago filamentoso M13 6,4  3 Lac Z Trasfezione Cosmidi 5-6 35-50 Antibiotico Infezione Cromosomi artificiali 7 fino a 300 Amp (CM) + Lac Z Elettroporazione BAC

Plasmide pBR322 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

pBR322: screening delle colonie ricombinanti Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Griffiths et al. , GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S. p. A Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Vettori plasmidici (pUC18) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Il gene LacZ codifica per il polipeptide β-galattosidasi (1021 a.a.) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Non c’è complementazione β-galattosidasi ATTIVA Ceppo di E.coli: gene Lac Z mutante: peptide parziale Vettore pUC: gene LacZ mutante: peptide parziale Complementano Ceppo di E.coli Lac Z mutante Vettore LacZ interrotto dal clonaggio Non c’è complementazione β-galattosidasi INATTIVA β-galattosidasi ATTIVA Colonie Blu Metabolizzato Terreno + X-Gal Colonie bianche Non metabolizzato β-galattosidasi INATTIVA X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

(induttore)

Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle cellule batteriche Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese competenti Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio Trasduzione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come plasmidi Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento

BATTERIOFAGO LAMBDA COME VETTORE DI CLONAGGIO Lambda w.t. = 50 Kb Estremità “cos” di 12 nt per circolarizzazione Infezione di E. coli

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Batteriofago lambda

Batteriofago lambda Lambda w.t. = 50 Kb Lambda di sostituzione: eliminati geni ciclo lisogenico, inserti fino a 23 Kb Clonaggio di frammenti DNA esogeno e packaging in vitro Infezione Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Creati siti unici per clonaggio Formazione di catenani T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

Fago difettivo (siti cos alterati) non può replicarsi ma produce proteine per i capsidi che possono essere purificate Fagi difettivi che da soli non producono capsidi. Le singole proteine possono essere purificate Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

CLONAGGIO IN BATTERIOFAGI Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Screening placche di lisi Infezione fagica Screening placche di lisi Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Fago filamentoso La cellula batterica non viene lisata! Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Fago filamentoso

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Clonaggio in cosmidi Formazione di catenani Formazione di colonie Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERIO (BAC) Fattore di fertilità F di E. coli ha 3 geni (parA, parB, repE) per la replicazione e per mantenere basso il numero di copie del fattore (1- 2 per cellula) Gene per la resistenza al cloramfenicolo (per selezione trasformanti) Siti di clonaggio nel gene LacZ (identificazione ricombinanti per complementazione) Inserto tra 150 e 350 Kb Integrazione batterica per elettroporazione Promotori per la trascrizione (T7 e SP6) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

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VETTORI DI CLONAGGIO IN LIEVITO: YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME) Saccharomyces cerevisiae: 16 cromosomi da 250 kb a 2 Mb

Sferoplasting: liticasi Inserto: 300 kb – 1 Mb Sferoplasting: liticasi Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

ARS = sequenze autonome di replicazione SUP 4 CEN = Centromero ARS = sequenze autonome di replicazione TRP1 e URA3 per selezione di molecole con entrambi i bracci URA 3 = gene per un enzima della sintesi dei nucleotidi pirimidinici TRP1 = gene per un enzima della sintesi del triptofano SUP 4 = gene per il tRNA per la tirosina che sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito ADE2 = gene per la sintesi di adenina: un precursore (fosforibosil amminoimidazolo) che sta a monte nella via biosintetica si accumula e dà colonie rosse S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre”. Nel codone UAU (tyr) nel gene ADE2 si verifica la mutazione “ochre” UAA “non senso” e diventa ADE2(-): l’adenina non viene sintetizzata e si accumula come premetabolita rosso

S. cerevisiae (w.t): crescono se nel in terreno c’è uracile e triptofano S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre” accumulo di premetabolita dell’adenina colonie rosse YAC con gene SUP 4 = gene per il tRNA con UAA Tyr* SUP 4 integro sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito: viene sintetizzata adenina, non c’è accumulo di premetabolita rosso colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC senza inserto (SUP attivo) colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC con inserto (SUP inattivo) colonie rosse

VANTAGGI E SVANTAGGI DEL CLONAGGIO IN YAC: - Chimerismo (co-saldatura di più regioni nello stesso YAC) - Instabilità (soprattutto a livello di regioni ripetute) - Co-trasformazione (più di uno YAC per cellula di lievito) Distribuzione dei cloni in griglie Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare in screening Allineamento dei cloni in contigui

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS