Editing dellRNA

Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

Editing dellmRNA per la subunità B di GluR

Editing inserzionale in Tripanosoma

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Editing di coxIII (mitocondri di tripanosoma)

Editing inserzionale mediante RNA guida

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Clonaggio PCR Amplificazione DNA

Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali

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sito di restrizione

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Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

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1.Origine di replicazione 2.Marcatore di selezione 3.Sito di restrizione unico Elementi di un vettore plasmidico

Vettori plasmidici

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

Preparazione del DNA da clonare Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dellmRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta frammentato con enzimi di restriz. frammentazione meccanica DNA specifico Collezione DNA (banca, genoteca) Digestione clone già esistente PCR

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Collezioni di DNA clonato (banca cDNA, genoteca)

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG VETTORE G CTTAA AATTC G INSERTO

strategie controlli Reazione di ligasi

Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO

trattamento del vettore con fosfatasi pAATTC G CTTAAp G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con singola digestione

Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Impacchettamento e infezione fagica In E.coli Elettroporazione In cellule di eucarioti superiori Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

Vettori plasmidici

Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

1200 bp SacI EcoRI

1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici

Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici

Spettro di assorbimento del DNA lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

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Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare HindIII

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite SondaGel SouthernDNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide NorthernRNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide WesternProteineAnticorpi Acrilammide

Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

Fattori che influenzano libridazione Temperatura Forza ionica pH

Esempio di Southern blot genomico

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