MICROSCOPIO OTTICO in campo chiaro - Il condensatore focalizza sul vetrino un cono di luce Gli Obiettivi contengono lenti di diverso potere di ingrandimento MICROSCOPIO OTTICO in campo chiaro - La base contiene una sorgente luminosa - Il braccio contiene due manopole per la messa a fuoco

INGRANDIMENTO: capacità di fornire un’immagine ingrandita dell’oggetto osservato POTERE DI RISOLUZIONE: capacità di distinguere come distinti due punti adiacenti l’ingrandimento dipende dall’obiettivo e dall’oculare e corrisponde al prodotto degli ingrandimenti delle singole lenti. E’ limitato dal potere di risoluzione il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche della luce (), l’apertura numerica dell’obiettivo e dall’indice di rifrazione del mezzo in cui è immersa la lente. Corrisponde a circa 200 nm

d = 0.5  Doveè la lunghezza d'onda della luce utilizzata La distanza minima tra due oggetti (d) affinchè questi possano essere osservati al microscopio come entità separate è detta POTERE DI RISOLUZIONE ed è data dall'equazione di Abbè: d = 0.5  Doveè la lunghezza d'onda della luce utilizzata n sin  n sin è l'apertura numerica  la lunghezza d'onda è uno dei fattori che influenza di più il potere di risoluzione

L’altro fattore che influenza il potere di risoluzione è l’apertura numerica (n sin  d = 0.5  n sin  Apertura numerica è la metà del cono di luce che entra nell’obiettivo dopo aver attraversato il condensatore Se il cono ha un angolo stretto non si espande molto dopo aver lasciato il vetrino  basso potere di risoluzione quanto più l'angolo del cono di luce che entra nell'obiettivo è largo tanto maggiore sarà il potere di risoluzione (diminuisce d e quindi la distanza minima che consente di distinguere due punti adiacenti)

il valore massimo di  è 90° e l'angolo del cono di luce che entra nell'obiettivo dipende dall'obiettivo e dall' indice di rifrazione (n) del mezzo in cui si trova la lente Quando la luce passa da un mezzo all’altro (aria-vetro) subisce il fenomeno di RIFRAZIONE, il raggio viene cioè deviato. INDICE DI RIFRAZIONE è una misura del grado con cui una sostanza rallenta la velocità della luce. Un prisma devia la luce in quanto il vetro ha un indice di rifrazione diverso dall’aria il valore massimo di  è 90° e sin90° = 1.00 sin  può al max essere 1.00 Nessuna lente che funzioni all'aria può avere un'apertura numerica superiore a 1.00

I raggi luminosi che non erano penetrati nell’obiettivo aumentare l’apertura numerica (n sin ) numerica superiore aumentando l'indice di rifrazione n e cioè non operare all'aria. l'uso di un olio per immersione con indice di rifrazione uguale a quello del vetro consente di aumentare l’apertura numerica rispetto a quella che si ha all’aria e quindi aumentare il potere di risoluzione I raggi luminosi che non erano penetrati nell’obiettivo vengono convogliati nell’obiettivo

n microscopio ottico ad immersione può al massimo avere un potere di risoluzione di 0.2 m microscopia in campo scuro: grazie ad un diaframma solo i raggi di luce non riflessi o rifratti dal campione arrivano all'obiettivo. Il campione osservato risulta illuminato in un fondo scuro

microscopia ottica (m.o.) m.o. ad immersione m.o. in campo scuro

microscopio a contrasto di fase: un diaframma anulare origina un cono di luce cavo. quando un raggio di luce colpisce un campione viene ritardata rispetto ad un raggio che non colpisce il campione i due raggi vengono rimessi in fase passando une lamina di fase e formeranno un'immagine definita

Microscopio a fluorescenza il campione (naturalmente fluorescente o reso fluorescente) viene colpito da luce UV l'energia accumulata viene poi rilasciata dal campione come luce a lunghezza d'onda più alta (visibile)

Cyanobacteria m.o. a fluorescenza dopo m.o. in campo chiaro aver illuminato il campione con luce a una lunghezza d’onda di 564nm Il colore rosso è dovuto ad autofluorescenza di pigmenti fotosintetici m.o. in campo chiaro

FISSAZIONE COLORAZIONE OSSERVAZIONE Visualizzazione →→ →→ microscopia Forma, Dimensioni, Disposizione, Caratteristiche tintoriali FISSAZIONE COLORAZIONE OSSERVAZIONE

FISSAZIONE COLORAZIONE ACIDO ACETICO CLORURO DI MERCURIO GLUTARALDEIDE A CALORE preserva la morfologia ma non le strutture interne FISSAZIONE CHIMICA ETANOLO ACIDO ACETICO CLORURO DI MERCURIO GLUTARALDEIDE FORMALDEIDE preserva le strutture subcellulari COLORAZIONE Colorare i batteri consente di: vedere maggiore contrasto tra l’organismo e lo sfondo differenziare vari tipi morfologici osservare determinate strutture subcellulari

COLORANTI COMPOSTI: si ottengono mescolando gli acidi e i I composti utilizzati per colorare i microrganismi: Contengono CROMOFORI (gruppi chimici che conferiscono alla sostanza il suo colore) Si legano alle strutture cellulari mediante legami ionici, covalenti o idrofobici COLORANTI ACIDI: la porzione colorata della molecola ha una carica negativa. Affinità per il materiale citoplasmatico. EOSINA, FUCSINA ACIDA, ROSSO CONGO, FLUORESCEINA, ACIDO PICRICO COLORANTI BASICI: la porzione colorata della molecola ha una carica positiva. Affinità per le strutture nucleari della cellula. BLU DI METILENE, FUCSINA BASICA, SAFRANINA, CRISTAL VIOLETTO COLORANTI COMPOSTI: si ottengono mescolando gli acidi e i (O NEUTRI) basici, colorano le strutture cellulari in modo diverso a seconda se acidofile o basofile

SOSTANZE MORDENZANTI:. aumentano l’efficienza della SOSTANZE MORDENZANTI: aumentano l’efficienza della colorazione permettendo al colorante di legarsi con maggiore affinità SOSTANZE FLUORESCENTI: hanno la capacità di emettere luce se illuminate ad una determinata lunghezza d’onda (visibile o UV). ARANCIO DI ACRIDINA, ACRIFLAVINA, FLUORESCEINA Tecniche di colorazione Colorazioni semplici: richiedono l’uso di un solo colorante Colorazioni complesse: applicazione successiva di più coloranti Colorazioni differenziali: consentono di distinguere tra loro microrganismi diversi

FISSAZIONE la fissazione può essere fatta al calore o con sostanze chimiche (etanolo, ac. acetico, formaldeide). Il calore preserva la morfologia cellulare ma può alterare le strutture interne. La fissazione chimica si usa per osservare le strutture intracellulari.

dopo la fissazione i campioni vengono colorati, lavati ed osservati Colorazione semplice dopo la fissazione i campioni vengono colorati, lavati ed osservati i coloranti devono avere un gruppo cromoforo e devono legarsi ai campioni coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, cristal violetto) - composti cationici, carichi positivamente che legano strutture e molecole cariche negativamente (parete cellulare, DNA) coloranti acidi (eosina, fucsina acida, rosa bengala) - composti anionici, carichi negativamente che legano strutture e molecole cariche positivamente

Colorazione differenziale permette di classificare i batteri in base alla loro reazione alla colorazione Colorazione per acido-resistenza (o di Ziehl-Neelsen) si usa per riconoscere batteri delle specie Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae la colorazione viene fatta a caldo con fucsina basica e fenolo. dopo la colorazione le cellule vengono lavate con acido solforico e etanolo. tutte le cellule batteriche, tranne quelle di Mycobacterium, si decolorano.

Colorazione di Gram si usa per classificare tutti i batteri in due gruppi, i Gram-positivi ed i Gram-negativi soluzione mordenzante Gram-negativi Gram-positivi

l’ingrandimento è limitato dal potere di risoluzione il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche della luce e corrisponde a circa 200 nm Per aumentare l’ingrandimento bisogna aumentare il limite di risoluzione SOSTITUZIONE DELLA LUCE CON GLI ELETTRONI

microscopio elettronico microscopio ottico lastra fotografica occhio oculare obiettivo lenti elettromagnetiche oggetto condensatore sorgente luminosa sorgente di elettroni

Microscopia elettronica il campione viene colpito da un fascio di elettroni (il sistema opera nel VUOTO) questo aumenta il potere di risoluzione rispetto ad un microscopio ottico, infatti il potere di risoluzione aumenta al diminuire della lunghezza d'onda della luce (la lunghezza d'onda di un fascio di elettroni e circa 0.005 nm -100000 volte più bassa della luce visibile) il potere di risoluzione del microscopio elettronico è circa 1000 volte superiore a quello del microscopio ottico e permette di distinguere due punti distanti tra loro 0.5 nm Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) i campioni devono essere fissati chimicamente (glutaraldeide o osmio e solventi organici) e poi inclusi in una resina inerte a formare un blocco da questi blocchi vengono fatte fettine sottilissime con un ultramicrotomo

le fettine vengono "colorate" con metalli pesanti (piombo, uranile) che si legano alle strutture biologiche e ne aumentano il contrasto alternativamente si fa una "colorazione negativa" (ombreggiatura) facendo depositare sulle cellule un velo di vapore di un metallo (platino) una tecnica alternativa è quella del freeze-etching che prevede il congelamento del campione in azoto liquido (-196°C) ed il taglio con una lama preraffreddata così le cellule si spezzano lungo le linee di minor resistenza (al centro della membrana) le superfici esposte vengono ombreggiate con platino facendo un "calco" delle superfici che poi è osservato per TEM

microscopio elettronico a scansione (SEM) scanning electron microscope il campione viene fissato e rivestito da uno strato metallico una sonda effettua una scansione del campione tramite un fascio molto sottile di elettroni quando il fascio di elettroni colpisce una cellula, gli atomi di superficie liberano elettroni (secondari) raccolti da un rivelatore

cellule batteriche osservate mediante TEM (ultrastuttura della cellula) cellule batteriche osservate mediante SEM (superficie delle cellule, immagine tridimensionale)

Microscopia Confocale (CSLM Confocal Scanning Laser Microscope) Diagramma del funzionamento di un microscopio laser a scansione confocale. Le linee gialle rappresentano la luce laser usata per illuminare il campione. Le linee rosse simbolizzano la luce che si diparte dal piano del fuoco; quelle blu, la luce proveniente da parti del campione al di sopra e al di sotto del piano del fuoco.

Confocal microscope images of Pseudomonas syringae growing in the leaf intercellular spaces of the model plant Arabidopsis thaliana. The bacteria are marked with green fluorescent protein, which contrast with the red fluorescence of chloroplasts in plant cells. il campione (reso fluorescente) colpito da un raggio laser focalizzato emette luce che viene concentrata da una lente in grado di bloccare la luce fuori fuoco con produzione di immagini di diverse sezioni ottiche si possono osservare campioni di notevole spessore che (dopo elaborazione al computer) possono originare immagini tridimensionali Bacteria (red fluorescence) show an intimate association with carbonate precipitates (blue autofluorescence). Sample is stained with propidium iodide; scale bar, 5m

Microscopio a scansione di sonda (SPM Scanning Probe Microscope) misura le strutture superficiali delle cellule grazie allo spostamento di una microsonda lungo la superficie dell'oggetto da osservare microscopio elettronico a scansione a effetto tunnel (STM Scanning Tunnelling Microscope) microscopio a forza atomica (AFM Atomic Force Microscope) potere di risoluzione molto elevato (100 milioni di volte); permette di visualizzare singoli atomi usato per studiare le superfici di cellule

High magnification AFM image of a single Pseudomonas putida bacterium on mica, scanned in air. Surface features on the bacterium are resolved. Bacterial flagellae can also be seen. Image size: 2 x 2 microns. Very high magnification AFM image of the surface of a single Pseudomonas putida bacterium showing clearly resolved features. Imaged on mica and scanned in air. Image size: 0.5 x 0.5 micron.

spore batteriche osservate mediante microscopia: ottica ad immersione ottica a fluorescenza AFM SEM

Dimensioni e forma della cellula procariotica

? batteri giganti 6000x800 nm (visibili a occhio nudo) nanobatteri o ultramicrobatteri (UMB) con diametro tra 200 e 50 nm ?

grappoli diplococchi tetradi sarcina streptococchi

coppie filamenti

vibrioni spirilli - spirochete

miceli

batteri pleiomorfi = a morfologia variabile