Modelli cellulari Modulo B Dal semplice Al complesso

La cellula rappresenta il modello sperimentale di elezione del biotecnologo per lo studio di: Struttura e funzione della cellula Meccanismi genetici di base: replicazione e divisione cellulare espressione genica Sviluppo e differenziamento cellulare: fisiologico patologico Modelli animali

The Living Cell Film Festival cell division show Cell division Fireworks cell on the move fast food Walking on the dark side Cell division Fireworks sequel Cytocalasin & actin Gnam gnam Epidermoblast division Cell highways Cell division Cell truks

Tissue culture of animal cells Tissue culture methods Tissue culture media Tissue culture plastic ware

Tecniche di analisi Acidi nucleici Proteine Funzioni cellulari Ibridazione Amplificazione Sequenziamento Proteine Elettroforesi Immunologiche Proteomiche Funzioni cellulari Trasfezione Interferenza

Tecniche di base per l’analisi degli Acidi Nucleici Tecniche di Ibridazione: in vitro (Southern & Northern Blot) in vivo (FISH) Tecniche di Amplificazione: PCR RT-PCR & qRT-PCR Tecniche di sequenziamento: Manuale (Sanger) Automatizzato (ABI) Lo scopo di queste tecniche è di caratterizzare il genotipo e/o il profilo di espressione genica Microarray

Tecniche di base per l’analisi delle Proteine Apparato base 2D Elettroforetiche: Isoelectric Focusing (IEF) SDS-PAGE 2D Immunologiche: Immuno-blot Immunofluorescenza Proteomiche: MS

Tecniche di base per l’analisi di alcune funzioni cellulari Separazione cellulare: Disgregazione tissutale con collagenasi Ficoll Affinità Crescita e migrazione: Colorazione vitale Incorporazione H3-dT FACS

Tecniche di base per l’analisi di alcune funzioni cellulari Trasfezione: Transiente Stabile Interferenza: RNAi

TRASFEZIONE TRANSIENTE No selezione neo

TRASFEZIONE STABILE Sì selezione

Retrovirus: virus a RNA a doppio filamento I VETTORI RETROVIRALI Retrovirus: virus a RNA a doppio filamento 5’-LTR 3’-LTR psi geni per la replicazione LTR (long terminal repeat) (ESSENZIALI); geni per la replicazione (gag, pol e env) (NON ESSENZIALI); psi (per l’assemblaggio delle particelle virali) (ESSENZIALI). INFEZIONE VIRALE: l’RNA è COPIATO in DNA dalla trascriptasi inversa (contenuta nel virione)  il DNA CIRCOLARIZZA e si INTEGRA nel DNA della cellula ospite per azione dell’integrasi (contenuta nel virione). I vettori retrovirali vengono costruiti MANTENENDO le SEQUENZE ESSENZIALI, LTR e psi, del genoma retrovirale. Sono vettori ‘SHUTTLE’.

1. Il costrutto è utilizzato per TRASFETTARE una specifica linea cellulare (cellule helper) che contiene, integrati nel genoma i geni gag, pol e env richiesti per la produzione del virus. Le cellule trasfettate SONO IN GRADO di produrre particelle virali contenenti UNA COPIA AD RNA DEL COSTRUTTO. 2. Queste particelle virali sono in grado di INFETTARE altre cellule (cellule target) che NON contengono i GENI gag, pol e env. Dal momento che le particelle virali CONTENGONO la TRASCRITTASI INVERSA e l’INTEGRASI preformate, in queste cellule l’RNA viene copiato in DNA a doppio filamento che poi si INTEGRA nel genoma della cellula infettata. Dal momento che queste cellule NON POSSIEDONO I GENI essenziali PER LA REPLICAZIONE VIRALE, NON si VERIFICHERA’ ulteriore PRODUZIONE di particelle virali.

Come funziona la RNAi

Human Umbelical Vein Endothelial Cells NHLF HUVEC Human Umbelical Vein Endothelial Cells NHLF Normal Human Lung Fibroblasts Human Hepatocytes Normal Human Epidermal Keratinocytes

Linee cellulari tumorali http://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/all/allIndex.cfm Tumor lines

MODELLI ANIMALI IN BIOLOGIA Invertebrati Vertebrati Caenorabditis elegans Drosophila melanogaster Danio rerio (zebrafish) Xenopus Ratto Topo

CARATTERISTICHE GENERALI DI ZEBRAFISH Piccolo pesce osseo d’ acqua dolce originario del fiume Gange Si nutre di piccoli invertebrati ed è predato da pesci, anfibi, uccelli e mammiferi Ciclo vitale molto rapido (da uovo ad adulto fertile in 7 giorni) La femmina depone un centinaio di uova alla volta con una frequenza settimanale Fecondazione e sviluppo avvengono esternamente Genoma di 1,8 x 109 bp organizzato in 25 cromosomi

ZEBRAFISH COME MODELLO ANIMALE Vantaggi economici Facili da reperire Basso costo Poco esigenti Allevabili in piccoli acquari Facili da riprodurre in cattività Vantaggi biologici Filogeneticamente più vicini all’uomo rispetto ai modelli invertebrati Facili da ibridare Grande quantità di embrioni a disposizione Sviluppo molto rapido Embrioni trasparenti durante tutto lo sviluppo Deposizione delle uova controllabile con l’esposizione alla luce Facili da manipolare

Possibilità di clonare individui da cellule somatiche Svantaggi Filogeneticamente meno vicini all’uomo rispetto a topi e ratti Genoma meno conosciuto rispetto ad altri modelli In conclusione OTTIMO MODELLO ANIMALE PER STUDI SULLA BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

SVILUPPO EMBRIONALE DI ZEBRAFISH

METODI DI STUDIO 1) Marcatura con sostanze fluorescenti Per seguire, tramite osservazione al microscopio, la migrazione di singole cellule o di piccoli gruppi durante l’organogenesi 2) Delezione (o innesto) di singole cellule nelle prime fasi dello sviluppo Consente di capire l’importanza relativa di una singola cellula nello sviluppo di un dato organo o tessuto Normale sviluppo Sviluppo alterato

3) Mutagenesi del maschio Consente di selezionare mutanti per un determinato carattere, come presupposto per studi a livello molecolare

4) Aploide ginecogenico uova embrioni aploidi sperma UV

5) Soppressione dell’espressione di una proteina con ‘antisense morpholino oligonucleotides ’ (M.O.) 5’- 7mG A A A A A A -3’ mRNA (della proteina X) M.O. 5’- 7mG A A A A A A -3’ dsRNA (intraducibile)

Studi sullo sviluppo dell’occhio e delle sue componenti (retina,coni, Alcuni studi condotti su zebrafish Studi sullo sviluppo dell’occhio e delle sue componenti (retina,coni, bastoncelli, cristallino, nervo ottico) es1: studio del mutante belladonna Retina in zebrafish wild-type Retina nel mutante belladonna es2: importanza del fattore trascrizionale Rx3 nello sviluppo dell’occhio attraverso lo studio di mutanti chk

Studio dell’ organogenesi (apparato digerente, cardiovascolare, ecc..) es:importanza del fattore trascrizionale Ptf1a-p48 nello sviluppo del pancreas Studi sullo sviluppo del sistema nervoso es1: espressione di beta1 tubulina nel SN dell’embrione e nell’adulto es2: espressione dei geni drd3 per il recettore D3 per la dopamina, e drd2a, b e c per i recettori D2 per la dopamina Studi sullo sviluppo embrionale delle gonadi es: importanza della chemochina SDF-1 nell’indurre la migrazione delle cellule progenitrici delle gonadi Studi sull’importanza delle adesioni cellulari durante lo sviluppo embrionale es1: espressione di caderina E es2: espressione di connessina 48.5 Studi sulla teratogenicità di sostanze capaci di inquinare le acque es: pesticidi come il sodio metame