DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE CANALE Approccio “classico” (nAChR, canale del sodio): Trovare un tessuto ricco di proteina Solubilizzare e purificare la proteina Ricostituire la proteina in doppi strati lipidici per verificarne la funzione Separare le subunità Sequenziarne piccole parti Sintetizzare corrispondenti sonde di DNA per identificare gli RNA messaggeri che codificano la proteina Deteminare la sequenza dei mRNA Predire la struttura

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh Trovare un tessuto ricco di proteina: membrane plasmatiche delle cellule dell’organo elettrico di Torpedo. Ciascuna cellula genera un impulso di corrente attraverso l’attivazione di un vasto numero di nAChR in risposta all’arrivo di pda nel terminale presinaptico colinergico. Un altro buon preparato è costituito dall’organo elettrico del pesce Electrophorus electricus : è anche un ottima sorgente di canali del Na+ voltaggio dipendenti e Na+-K+ ATP-asi.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh Solubilizzare e purificare la proteina: le proteine sono poste in soluzione con detergenti appropriati per formare piccole micelle contenenti una proteina. Le micelle contenenti un nAChR sono separate dalle altre su colonne di affinità utilizzando specifici ligandi colinergici o neurotossine (a-bungarotossina).

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh Separare le subunità: il materiale purificato viene dissociato in subunità mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in SDS (sodio dodecil solfato). Il recettore è risultato composto da 4 subunità a,b,g,d con peso molecolare di ca 40, 50, 60 e 65 kDa. Il peptide è un complesso pentamerico a2bgd. Le due subunità a contengono i siti di legame per a-bungarotossina e per ACh come dimostrato tramite esperimenti condotti ricostituendo il canale in doppi strati lipidici.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh Sequenziarne piccole parti e determinare la sequenza dei mRNA: sono state determinate le sequenze di amino acidi del N-terminale (circa 50 residui). Questo ha permesso di disegnare corrispondenti sonde di DNA per clonare il gene. La totalità del mRNA dell’organo elettrico di Torpedo è stato copiato dall’enzima trascrittasi inversa ottenendo trascritti di cDNA. Questi sono stati inseriti nel DNA di un plasmide usato per trasformare cellule di Esterichia Coli ottendo una libreria di cDNA. Centinaia di migliaia di cloni (colonie batteriche) sono state esaminate per ibridizzazione per trovare sequenze corrispondenti alle sonde.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh Le sequenze delle 4 subunità di Torpedo sono identiche per il 43-64%; sono composte da 437 (a) a 501 (d) residui aminoacidici. Il complesso pentamerico è composto da 2380 residui e la massa molecolare della proteina è di 268 kDa Per verificare che la sequenza trovata corrisponda effettivamente ad una proteina funzionale se ne induce l’espressione eterologa in cellule che normalmente non la esprimono. Gli mRNA sono iniettati in oociti (uova immature) di Xenopus Laevis, oppure linee cellulari vengono transfettate (COS, CHO, HEK) e che vengono poi studiate con tecniche elettrofisiologiche.

I cDNA e gli mRNA da loro ottenuti per le 4 subunità sono stati coiniettati nell’oocita: dopo alcuni giorni, sono state osservate correnti sensibili a ACh e a-bungarotossina. Nel caso in cui venga omesso il messaggio per la subunità a, non si osserva più alcuna risposta.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE CANALE Predire a partire dalla sequenza primaria la struttura atomica tridimensionale della proteina (piccole proteine) Utilizzare in combinazione tecniche biochimiche, di biologia molecolare, elettrofisiologiche e cristallografiche

TOPOLOGIA DI UNA PROTEINA CANALE QUALE PARTE DELLA SEQUENZA DI UNA PROTEINA ATTRAVERSA IL DOPPIO STRATO, QUALE E’ RIVOLTA NEL LATO CITOPLASMATICO, QUALE NEL LATO EXTRACELLULARE. Plot di idropatia Mutagenesi mirata Anticorpi diretti contro segmenti della sequenza o epitopi inseriti nella sequenza Fosforilazione di serine, treonine o tirosine da parte di proteine chinasi Utilizzo di sostanze che reagiscono con i gruppi cisteina-SH

Passaggi transmembrana: a-eliche di 20-27 residui orientate ad angoli di 10-30° dalla perpendicolare; foglietti b di 9-13 amino acidi

PLOT DI IDROPATIA E TOPOLOGIA ASSUNZIONE: i segmenti transmembrana sono a-eliche e gli amino acidi nella membrana sono idrofobici

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X CRIOMICROSCOPIA ELETTRONICA: PERMETTE L’ ANALISI CRISTALLOGRAFICA GRAZIE A TECNICHE DI RICOSTRUZIONE DI IMMAGINE COMBINANDO UN ELEVATO NUMERO DI MICROFOTOGRAFIE ELETTRONICHE OTTENUTE AD ANGOLI E PIANI FOCALI DIFFERENTI. IL PREPARATO E’ RAPIDAMENTE CONGELATO IMMERSO NEL DOPPIO STRATO LIPIDICO Torpedo AChRs SI TROVANO NELLE MEMBRANE IN ALTA DENSITÀ E IN UN RETICOLO ORDINATO: LA MEMBRANA FORMA SPONTANEAMENTE DELLE STRUTTURE TUBULARI IN CUI LE PROTEINE SI TROVANO ORDINATE IN ELICHE CHE SPIRALEGGIANO LUNGO IL TUBO. CIASCUNA IMMAGINE OTTENUTA DA UN TUBO CONTIENE PROTEINE ORIENTATE A VARI ANGOLI

STRUTTURA E FUNZIONE DEI CANALI IONICI VOLTAGGIO DIPENDENTI

RUOLO DELLE SUBUNITA’ AUSILIARIE regolazione dell’espressione regolazione della cinetica di attivazione e di inattivazione (modello a palla e catena) regolazione delle proprietà farmacologiche