Coltura Cellulare ●Insieme di cellule mantenute “in vitro”, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. ●Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita.

Coltura Cellulare

Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calore rosso su fiamma Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 °C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo l’uso

Laboratorio di Coltura Cellulare Spazio o area di lavoro Abbigliamento da laboratorio Reagenti colturali Vetreria e Plastica di laboratorio Cappa a flusso laminare

CAPPA A FLUSSO LAMINARE Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente

Cappa a flusso laminare di classe II

●Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologiche. ●Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita -Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico

Condizioni fisico-chimiche ●All’interno dell’organismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di pH, protezione, mantenimento della temperatura…) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo. Una volta che le cellule sono nel terreno di cultura, queste funzioni, oltre all’ambiente di coltura, devono essere sostituite dallo strumento.

Condizioni fisico-chimiche ● pH 7.2-7.4 ● Sistema tampone (NaHCO3) ● Temperatura 35-37°C

Condizioni fisico-chimiche ● Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente. ● Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37°C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30°C o 34°C.

Condizioni fisico-chimiche ●Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere costante il pH ●Il pH del terreno dipende generalmente dalla %CO2 nell’incubatore ●La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH desiderato

Relazione tra [NaHCO3] e il pH

Condizioni fisico-chimiche ● In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita. rosso-arancio a ph 7.3 rosso-viola a ph alcalino giallo-arancio a ph acido Rosso Fenolo

●La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al 4.6- 5.9% di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

●Triturazione tessuto ● I frammenti vengono sottoposti all’azione di agenti chelanti (EDTA,) o enzimi proteolitici (tripsina o collagenasi) che degradano la matrice del tessuto

Sospensione Cellulare Mista Approcci per separare i diversi tipi cellulari: ●proprietà fisiche ●capacità di adesione ●proprietà di legame con anticorpi specifici ●uso di terreni o condizioni di coltura selettivi

Tipi di Coltura di Cellule “in vitro” Coltura Primaria Coltura Secondaria

Coltura Primaria ●Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita) Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine

Ciclo vitale di Cellule Primarie

Linea Cellulare Continua ●Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte ● Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare

Coltura Primaria Coltura a breve termine Coltura a lungo termine < 10 duplicazioni 50-60 duplicazioni

Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150-200 duplicazioni

Linea Cellulare Continua Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre un anno Immortale

Le prime Linee Cellulari Continue 1952, Johns Hopkins University 1963, University of Ibadan HELA RAJI

Medium di Coltura ●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule ●I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco’s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni Medium di Coltura Sali inorganici Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo ▪ Cloruro di calcio anidro ▪ Solfato di magnesio anidro ▪ Cloruro di potassio ▪ Nitrato di potassio ▪ Cloruro di sodio ▪ Fosfato di sodio bibasico ▪ Bicarbonato di sodio

Medium di Coltura Vitamine Biotina Pantotenato Acido folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12 Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche

Amminoacidi-isomeri L Medium di Coltura Amminoacidi-isomeri L Alanina Arginina Asparagina Acido aspartico Cisteina Glutamina Acido glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina Necessari per la sintesi delle proteine

Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio Medium di Coltura Zuccheri Glucosio Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio per le biosintesi

Medium di Coltura Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)

SIERO Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

SIERO

Sistemi di Crescita ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi) Fenomeno che richiede l’interazione di recettori di membrana con proteine adesive, adsorbite sulla superficie della piastra di coltura SOSPENSIONE: cellule di origine ematopoietica (che normalmente vivono in un mezzo fluido)

Distacco delle cellule in adesione Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l’adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato

Protocollo di tripsinizzazione ●Lavare le cellule (2X) con PBS (phosphate buffered saline) ●Aggiungere un volume adeguato di tripsina (pre-riscaldata) ●Incubare a 37°C per almeno 3 min ●Neutralizzare la tripsina con medium completo di FBS ( che contiene inibitori della tripsina)

Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità Protocollo di tripsinizzazione ●Trasferire la sospensione ina provetta e centrifugare 5 min per 900-1000 giri al min ●Aspirare il sovranatante ●Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule ●Distribuire nelle nuove piastre Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule fuori dall’incubatore il minor tempo possibile

Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene: -materiale rigido con superficie lucida -buona resistenza chimica a soluzioni acquose -limitata resistenza a solventi -totale assenza di tossicità per le cellule in coltura -trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio -la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

Efficienza di semina Tempo di duplicazione -Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente -Regola generale: densità > 104 cellule/cm2 Tempo di duplicazione -La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione -Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule umane

Piastre

Tipi di Piastre Diametro (mm) Superficie (cm2) Volume (ml) 35 8 1-2 60 21 4-5 100 55 10-12 150 148 20-30

Multi-well

Tipi di Multi-well Multi-well Superficie (cm2) Volume (ml) 96 0,32 0,1-0,2 48 1,0 0,3-0,6 24 1,88 0,5-1,2 12 3,83 1,0-2,4 6 9,40 2.0-3,0

Fiasche

Tipi di Fiasche Fiasche Superficie (cm2) Volume (ml) T-25 25 5-10 T-75 15-25 T-150 150 30-50 T-175 175 35-60 T-225 225 45-70

Morfologia Colturale Cellule aderenti Cellule semi-aderenti Cellule in sospensione

Linee Cellulari Continue Aderenti Epithelial Endothelial Fibroblast Neuronal

Linee Cellulari Aderenti Epiteliali

Linee Cellulari Aderenti Epiteliali Hela

Linee Cellulari Aderenti Epiteliali

Linee Cellulari Aderenti Endoteliali

Linee Cellulari Aderenti Endoteliali ATCC CPAE is an endothelial cell line derived from the main stem pulmonary artery of a young cow (Bos taurus). This line was initiated in January, 1979 by P. Del Vecchio from artery lumen scrapings dispersed by enzyme treatment. Subsequent to the publication of the sixth edition of the ATCC catalog, tests for bovine diarrhea virus (BVD) have indicated that CPAE cells test positive for BVD viral antigen Medium: Minimum essential medium (Eagle) with 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, and 1.0 mM sodium pyruvate, 80%; fetal bovine serum, 20% Remove medium, and rinse with 0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution. Remove the solution and add an additional 1 to 2 ml of trypsin-EDTA solution. Allow the flask to sit at room temperature (or at 37C) until the cells detach. Freeze medium: culture medium 95%; DMSO, 5%

Linee Cellulari Aderenti Endoteliali CPAE a bassa densità

Linee Cellulari Aderenti Fibroblastoidi

Linee Cellulari Aderenti Fibroblastoidi COS-1

Linee Cellulari Aderenti Neuronali

Linee Cellulari Aderenti Neuronali NEURO 2-A

Linee Cellulari Continue Semi-Aderenti

Linee Cellulari Continue Semi-Aderenti

Linee Cellulari Continue Semi-Aderenti CCRF-CEM

Linee Cellulari Continue in Sospensione a singole cellule a piccoli clumps a grandi clumps

A Singole Cellule

A Singole Cellule BV-173

A Singole Cellule K-562

A Singole Cellule NB-4

A Piccoli Clumps

A Piccoli Clumps Kasumi-1

A Grandi Clumps: il caso delle PC-12

A Grandi Clumps PC-12

A Grandi Clumps PC-12

“In Aderenza” PC-12

“In Aderenza” PC-12

Conta Cellulare Diversi metodi: un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro o camera di Burker -La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

Camera di Burker

Camera di Burker

Procedura per Conta Cellulare Preparare la sospensione cellulare Trasferire una piccola quantità di sospensione cellulare nella camera del vetrino, permettendo il riempimento per capillarità Contare le cellule nel quadrato centrale e nei quattro quadrati agli angoli Ciascun quadrato ha un volume di 0.1mm3

Protocollo di Conta Cellulare 2 aree rettangolari e 2 reticoli di conta Ogni reticolo di conta è costituito da 9 quadrati delimitati da linee triple Ciascuno dei 9 quadrati è costituito da 16 quadrati minori separati da doppie linee -Si contano almeno 3 quadrati delimitati da linee triple ed ogni quadrato corrisponde ad 1/10mm3 = 1/10 ml (1mm3 = 1 ml ) -Si effettua una media aritmetica delle cellule contate -Si moltiplica la media per il fattore di diluizione pari a 10.000 (0,1 ml= 0,0001 ml)

Numero di cellule -La sospensione cellulare viene risospesa in egual volume di Trypan blue -La sospensione viene fatta scorrere per capillarità all’interno della cameretta -Si contano le cellule non colorate e quelle colorate

Concentrazione Cellulare (cell/ml) N° cellule vitali (media dei 3 quadrati) X 10000 X 2 Percentuale di Vitalità -Il trypan blue è in grado di colorare le cellule necrotiche -Percentuale di vitalità: N° cellule vitali/N°cell. non vitali + cellule vitali X 100

Contaminazioni Micoplasma Cross-Contaminazione

Metodi per svelare una cross-contaminazione Morfologia e Pattern di Crescita Immunofenotipo Identificazione di marcatori molecolari DNA Fingerprinting Cariotipo e Analisi Citogenetica

Durante la Stabilizzazione LINEA B LINEA A

LINEA A LINEA B

LINEA A LINEA B

False leukemia-lymphoma cell lines: an update on over 500 cell lines HG Drexler et al, Leukemia 2003

Una linea cellulare cross contaminata non rappresenta più un modello di studio per comprendere la biologia delle cellule oggetto del nostro interesse

Micoplasmi “ MINIMUM CELL” Rappresentano un grande gruppo di microorganismi caratterizzati tutti dalla mancanza di una parete cellulare rigida “ MINIMUM CELL” Membrane Ribosomi Cromosoma

Tassonomia dei Micoplasmi Classe Mollicutes 3 Ordini Anaeroplasmatales Mycoplasmatales Acholeplasmatales Generi Mycoplasma Ureaplasma Spiroplasma Generi Anaeroplasma Asteroleplasma Genere Acholeplasma

CARATTERISTICHE SALIENTI Dimensioni estremamente ridotte: 0.3-0.8mm Filtrabili a 0.45mm Morfologicamente polimorfici Alta richiesta metabolica di vitamine, precursori di acidi nucleici, lipidi, acidi grassi ed aminoacidi Sono tutti commensali, parassiti oppure patogeni Le infezioni sono spesso difficili da diagnosticare: la presenza di tali agenti può passare del tutto inosservata all’operatore e può provocare cambiamenti profondi nel metabolismo e nelle proprietà delle cellule

Frequenza della Contaminazione 15-35% delle linee cellulari continue 5% delle colture cellulari a precoci passaggi 1% delle colture cellulari primarie

Comuni Specie Contaminanti M. Orale 20-40% M. Fermentans: 10-20% M. Hominis 10-20% UOMO M. Arginini 20-30% M. Laidlawii 5-20% BOVINO MAIALE M. Hyorhinis 10-40%

Sorgenti di Contaminazione M. Arginini 20-30% M. Laidlawii 5-20% BOVINO M. Hyorhinis 10-40% Maiale SIERO

Sorgente di Contaminazione Personale del Laboratorio M. Orale M. Fermentans M. Hominis Uomo Personale del Laboratorio

Linee Cellulari Continue Diventano la fonte principale di contaminazione grazie: alla generazione di minuscole gocciole durante la manipolazione alla prolungata sopravvivenza del micoplasma in forma essiccata alla contaminazione dei reagenti utilizzati rappresentati soprattutto dal terreno colturale

Effetti della Contaminazione Alterati livelli di sintesi di proteine, RNA e DNA Alterazione del metabolismo cellulare Induzione di aberrazioni cromosomiche Alterazione del pattern immunofenotipico Alterazione della morfologia cellulare Induzione o Soppressione di citochine Interferenza con saggi biochimici e biologici Influenza sulla trasduzione del segnale Alterazione del pattern di crescita e della vitalità Graduale Degenerazione PERDITA