PROGRAMMA Organizzazione della Cellula Eucariotica; Il Ciclo di Divisione Cellulare; Espressione dei Geni.

Un approccio multidisciplinare di tipo biochimico, chimico e genetico risulta fondamentale per lo sviluppo di tecniche dedicate a: Studio di popolazioni cellulari; Purificazione di acidi nucleici e proteine; Determinazione della struttura e dinamica molecolare di acidi nucleici e proteine; Studio dei sistemi di trasmissione da cellula a cellula, dal citoplasma al nucleo, ecc…

l’Unità Elementare di Attività Biologica Che cos’è una CELLULA? La Cellula è l’Unità Elementare di Attività Biologica

Consideriamo un dispositivo costituito da un recipiente contenente un certo numero di cellule viventi in un ambiente costituito da un terreno nutritizio liquido:

I Osservazione Le cellule sono capaci di sopravvivere e di riprodursi; Il loro numero aumenta nel tempo; L’attività proliferativa continua finché non si sono esaurite le risorse nutritive dell’ambiente ed i prodotti di rifiuto non sono troppo concentrati; Quando l’attività proliferativa si è arrestata, può essere ripresa se la coltura viene diluita con altro terreno fresco.

Curva di Crescita di Cellule di Mammifero coltivate in vitro

A = B II Osservazione A= Composizione chimica del terreno nutritivo B= Composizione chimica delle cellule A = B La composizione chimica delle cellule è diversa da quella dell’ambiente in cui si trovano

III Osservazione A= Variazione della composizione chimica del terreno nutritivo B= Misurare eventuale variazione della composizione chimica delle cellule A = Variabile B = Costante

CONCLUSIONI Le cellule devono essere delimitate da una struttura che le separa dal mezzo ambiente detta membrana cellulare o membrana plasmatica; La barriera di permeabilità della membrana non è assoluta, ma selettiva.

Definizione secondo Loewy e Siekevitz, 1974 La cellula è un’unità fondamentale di attività biologica, delimitata da una membrana dotata di permeabilità selettiva, e capace di autoriprodursi in un ambiente in cui non vi sono altri sistemi viventi.

Modelli di Organizzazione Cellulare Modello Procariote Modello Eucariote

Modello Procariote La parete cellulare costituisce una barriera porosa non selettiva; La membrana cellulare è una barriera permeabile altamente selettiva per l’ingresso della maggior parte delle sostanze; Il modello procariote è sprovvisto di compartimentazioni interne; Vi è una semplice organizzazione dell’apparato informazionale che è confinato in una distinta area nucleare; Grandissima capacità di adattamento alla sopravvivenza che consente di superare rapidamente le modificazioni improvvise delle condizioni ambientali; All’interno dei procarioti non ci sono ampie differenze; I procarioti non sono in grado di costituire organismi multicellulari.

Modello Procariote

Modello Eucariote Questo modello è caratterizzato da un elevato grado di compartimentazione interna; Il materiale informazionale è confinato al nucleo che a sua volta è separato dal citoplasma da un involucro nucleare; Il citoplasma contiene numerosi organelli delimitati da membrane e diversi per struttura, organizzazione e funzione; La possibilità di privilegiare l’una o l’altra delle funzioni cellulari specifiche, consente il processo di differenziamento; La specializzazione strutturale e funzionale comune a più cellule consente loro di riunirsi in associazioni funzionalmente integrate quali quelle rappresentate dagli organismi multicellulari; Sono presenti anche organismi unicellulari come il lievito.

Modello Eucariote

Relazione tra Dimensioni del Genoma e Complessità Biologica

Metodi di Indagine della Cellula I metodi di indagine possono essere suddivisi in: Metodi Analitici (Microscopia e Citometria) Metodi Preparativi (Centrifugazione, Cromatografia, Agglutinazione e Cell Sorter)

CITOMETRO A FLUSSO

BANCO OTTICO = LASER E SENSORI

DEFINIZIONI Flow Cytometry Misura le proprietà delle cellule in flusso Flow Sorting Separa le cellule sulla base delle proprietà misurate Gli strumenti sono anche definiti: Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)

Fluidica Ottica Elettronica Consente alle cellule di passare In fila indiana attraverso Un volume illuminato (camera di conta) in cui esse Disperdono (SCATTER) la luce ed emettono fluorescenza Che è raccolta, filtrata e Convertita in valori numerici o digitali Che sono salvati in un computer. Fluidica Ottica Elettronica

SCATTER LATERALE = X = Side Scatter = Right Scatter = Scatter a 90° LASER Otturatore SCATTER FRONTALE = Y = Forward Scatter = Scatter a 180 ° Fotomoltiplicatore Fotodiodo

Scatter Frontale=Scatter a 180°=Forward Scatter (FWSc) è una MISURA della DIMENSIONI CELLULARI. Scatter Laterale=Scatter a 90°= Side Scatter (SSC)=Right Scatter (RTSC) è una MISURA della COMPLESSITA’ INTERNA DELLA CELLULA, ad es. Granulosità Intracitoplasmatica. y x

90 deg Scatter FALS Scatter FSC 90°SC

I fluorocromi sono molecole (in genere proteine) in grado di essere eccitate ad una determinata lunghezza d’onda e di emettere luce ad un’altra ben specifica lunghezza d’onda FLUOROCROMI I filtri dicroici sono dispositivi che, colpiti da un raggio luminoso, sono in grado di far passare la luce caratterizzata da una certa lunghezza d’onda e di rifletterla ad un’altra lunghezza d’onda Filtri Dicroici Bandpass Filter Tali filtri permettono il passaggio di determinate lunghezze di onda all’interno di un range e rigettano, senza rifletterle, quelle al di fuori del range

Optical Design Filters Dichroic Sample Flow cell Bandpass Filters PMT 5 PMT 4 Filters Dichroic Sample PMT 3 Flow cell PMT 2 Scatter PMT 1 Laser Sensor Bandpass Filters

PE-TR Conj. Texas Red 630 PI Ethidium PE 575 510 FITC Common Laser Lines 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 PE-TR Conj. Texas Red 630 PI Ethidium PE 575 510 FITC cis-Parinaric acid

Listmode File FILEVERSION;1.15 BTRIEVE;7058418 IBA13-2 collected 6/27/95;28/6/1995;;2;1 PARAM;LS1;400;LS2;600;FL1;460;FL2;400;FL3;300;WID;TIM GAIN;1;1;2;2;0 THRES;0;10;0;5;0;5;1;11;0;5 FLUIDIC;3;4;1;7.20 FCM;357;2;2;1;1;0;0;1;1;1;1;0;1;1;0;1 SUBTRACT;15;0 AUTOCYCLE;1;0;0;0;0;0;0;-1;1;20000;7;0;1;0;1;0 PCBUFFER;374000;1 SERIAL;2 ADBOARD;1;0;0;30;0 PEAKAREA;0;0;0;0 CALIBRATION;300;300;300;300;0;0;0;0 MAINWINDOW;1 PRINTHEADER; Flow cytometry Report;Win-Bryte software - Bryte-HS flow cytometer PRINTFOOTER; Purdue University Cytometry Laboratories PRINTSTATISTICS;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;0;0;1;20;15;1;8;12;5;0;0;5 ROI;1;1;3;3;4;45;65;61;65;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;bird;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0 ROI;2;1;3;3;0;121;41;141;41;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;human;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0 ROI;7;3;5;1;0;0;18;24;63;52;48;16;2;0;2;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;5;255;0;0 ROIDATACYTO;7;20022;4845.7;98.7;0.0 ROIDATAHIST;1;2.4;16712;52;53;4044.6;2.4;53;83.5;0.0 ROIDATAHIST;2;2.2;1875;128;128;531.3;1.7;128;7.8;0.0 HISTOGRAM;FALS;24;49;290;320;256;0;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255 HISTOGRAM;SIDE-SCATTER;290;49;556;320;256;1;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255 CYTOGRAM;LS1-LS2;24;320;290;591;64;1;0;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;O;0;1;0;0;S;0;6;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;6;-1;-1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255 HISTOGRAM;FL2;290;320;556;591;256;3;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;255;0;0;1;1;C;10;1;1;1;S;0;0;1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;0;7;-1;1;1;1;255;0;255 CYTOGRAM;FL2-TIM;556;320;822;591;64;6;3;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;I;0;1;0;0;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255 LISTDATA 226;0;426;426;243;81;0 412;225;8;426;426;239;0 380;262;2;427;427;245;0 578;348;0;412;412;239;0 529;377;0;431;431;240;0 420;203;0;438;438;243;0 444;221;0;427;0;240;0 383;215;0;421;421;238;0 735;716;0;1027;1027;280;0 499;228;0;431;431;239;0 531;328;0;433;433;241;0 520;218;0;423;423;243;0 471;252;0;425;425;244;0 652;298;0;441;441;240;0 561;291;0;421;421;240;0 608;307;0;415;415;241;0 541;231;0;424;424;245;0 Listmode File

Analisi dei quattro quadranti log PE (+ +) ( - +) (+ -) (- -) 3 4 1 2 Analisi dei quattro quadranti

Strategie di Gating 1P Fluorescence 2P Fluorescence FALS Scatter 90 deg Scatter FALS Scatter 1P Fluorescence 2P Fluorescence log PE

…Back Gating… In un campione di sangue periferico, noi possiamo operare un gate su una putativa popolazione che per le quelle date proprietà fisiche si identifica, per esempio, con i linfociti. Comunque, può accadere che a quella data putativa popolazione linfocitaria si sovrappongano altri tipi cellulari. Mediante l’utilizzo di un marker di fluorescenza che identificherà i putativi linfociti di interesse, noi possiamo tracciare un altro gate sulla regione positiva a quel dato marker e operando un backgating, cioè re-impostando i parametri fisici sul gate di fluorescenza, identificheremo soltanto le cellule positive a quel dato marker di fluorescenza utilizzata.

Colture Cellulari

Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovute a microrganismi provenienti da fonti esterne; Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi.

Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calor rosso su fiamma; Sterilizzazione al calor secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2h ed è’ particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121°C per almeno 15 min. E’ particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e della vetreria di laboratorio dopo l’uso

Laboratorio di Colture Cellulari Area di Lavoro Abbigliamento di Laboratorio Reagenti Colturali e Vetreria Cappa a Flusso Laminare

Le cabine a flusso laminare verticale sono concepite per la protezione del prodotto e dell'operatore durante la manipolazione di materiale non patogeno. Sono particolarmente indicate nel caso sia preferibile non investire l'operatore con il flusso d'aria proveniente dalla zona di lavoro (manipolazione di sostanze allergizzanti o potenzialmente tali, maleodoranti, finemente polverose). Tra le applicazioni più comuni rientrano la manipolazione di prodotti che devono conservare la sterilità, in particolare colture cellulari e materiale biologico sterile, comunque sempre non patogeno, nonché la preparazione e ricostituzione di farmaci.

CARATTERISTICHE: Flusso laminare verticale sul piano di lavoro; L'aria espulsa viene sottoposta a filtrazione assoluta; La camera interna è di acciaio inox con angoli arrotondati per facilitare la disinfezione; L’apertura di lavoro è frontale E’ presente un sistema di allarme in caso di imperfetto funzionamento dei motoventilatori.

Cappa a Flusso Laminare di Classe II Pressione positiva e flusso laminare 30% 70% Aria filtrata tramite filtri HEPA al fine di proteggere il microambiente da sostanze a rischio biologico Aria esterna Campi d’applicazione: Microbiologia, Virologia, Ematologia, Colture Cellulari e DNA ricombinante. Il flusso laminare e la pressione positiva che si creano all’interno della cappa consentono di ottenere una barriera di protezione che previene il contatto delle sostanze dannose con l’operatore e quindi anche con l’ambiente esterno. I filtri HEPA consentono di eliminare le varie sostanze a rischio biologico che possono provenire sia dall’interno della cabina di lavoro che dall’esterno con un’efficienza del 99,995%.

Il Ruolo di una Biomolecola In Vivo usando Singoli Animali In Vitro e quindi in un Ambiente Artificiale

Colture a Breve Termine di circa 24h di Tessuti o Organi Richiesta di Soluti Inorganici Soluzioni Saline Fisiologiche Necessità di Ossigeno Perfusione Temperatura (37°C) e pH (7.2-7.5)

Differenti Tipi di Coltura di Cellule in Vitro Coltura Primaria Coltura Secondaria

Coltura Primaria Coltura a Breve Termine Coltura a Lungo Termine < 10 duplicazioni 50/60 duplicazioni

Linea Cellulare Continua Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150/200 duplicazioni

Linea Cellulare Continua E’ capace di crescere indipendentemente dall’organismo originale da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre 1 anno Immortale

Linea Cellulare Continua Subclone derivata dalla linea cellulare parentale, ma con caratteristiche divergenti/uniche Linee sorelle simultanee stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima della semina Linee sorelle seriali stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)

Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari Estremamente Difficile Rari Successi e Non Prevedibili Importanza delle Aberrazioni Cromosomiche e/o Mutazioni Genetiche Diagnosi vs Ricaduta: diverse percentuali di successo

The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000. Scarsa riproducibilità della metodica in altri laboratori The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000.

IN VIVO EX VIVO Incubatore La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi corporei è significativamente più bassa di quella dell’aria. Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%. EX VIVO La pressione parziale di ossigeno negli incubatori al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!! In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di ossigeno tra 1-10%. Alcune cell lines crescono al 5% di ossigeno ed il 6% di anidride carbonica Incubatore

Deterioramento della Coltura Le cellule neoplastiche cessano di proliferare Overgrowth di fibroblasti o macrofagi Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+ Possibili ragioni B

LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI Medium di coltura: RPMI 1640, IMDM, McCoy’s, Alpha MEM e DMEM Fattori di crescita: EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6, SCF, PHA e CM Supporto colturale (plastica) Concentrazione cellulare Superamento della crisi di stabilizzazione

Medium di Coltura “Ioni Inorganici” Ioni Inorganici Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di Sodio

“Aminoacidi-Isomeri L” Medium di Coltura “Aminoacidi-Isomeri L” Alanina Arginina Asparagina Acido Aspartico Cisteina Glutamina Acido Glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Medium di Coltura “Vitamine” Biotina Pantotenato Acido Folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12

Medium di Coltura “Altri Componenti” Glucosio Hepes Rosso fenolo Sodio - Piruvato Siero fetale bovino (10 oppure 20%) Aminoacidi non-essenziali

La membrana Plasmatica: Individualità e Socialità della Cellula (T. Alescio et al.) SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA Isolamento; Comunicazione; Compartimentazione; Integrazione funzionale intracellulare.

ISOLAMENTO E’ una condizione necessaria a garantire l’individualità del corpo cellulare e la sua integrità chimica; tale condizione è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi come una vera e propria barriera selettiva. Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa da quella dell’ambiente; Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica e metabolica; Ogni cellula mantiene l’autonomia eventualmente necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il processo evolutivo.

2. COMUNICAZIONE Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico aperto, l’isolamento non può essere assoluto ed i sistemi di comunicazione devono assolvere a 3 compiti: Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto; Capacità di ricevere dall’esterno stimoli e segnali in maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli stimoli ricevuti; Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale di tutte le componenti dell’organismo.

3. COMPARTIMENTAZIONE NUCLEO E’ una condizione tipica degli eucarioti nei quali l’esistenza di sistemi intracellulari di membrane suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti ciascuno dei quali può acquisire una propria attività specializzata. NUCLEO LISOSOMI

4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE La membrana plasmatica e le membrane intracellulari svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a svolgere funzioni collegate ed interdipendenti

Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il rispettivo substrato è proporzionale alle loro concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel momento in cui i movimenti disordinati di diffusione entro la cellula, conducono all’interazione di substrati ed enzimi.

Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente associati l’uno all’altro in un grande complesso multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.

Un’intelligente strategia biologica è quella di inserire una sequenza di molecole funzionalmente interdipendenti nella compagine di un tratto di membrana plasmatica o intracellulare; questa, quindi, può offrire, nel caso del complesso multienzimatico, la struttura di supporto richiesta per la sua integrazione funzionale.