Federica Camin Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento) ANALISI DEI RAPPORTI TRA ISOTOPI STABILI DI BIOELEMENTI IN ALIMENTI (OLIO) Federica Camin Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)

Isotopo (iso+topos) = stesso posto Esistono 9 tipi di ossigeno diverso (3stabili 161718) e gli altri instabili dal 12 al 20 Stabili (260) ISOTOPI (in totale circa 1700) Radioattivi

hanno lo stesso n° atomico (Z) ma un diverso n° di massa (A) Isotopi di uno stesso elemento = hanno lo stesso n° di protoni (e quindi di elettroni) ma un diverso n° di neutroni hanno lo stesso n° atomico (Z) ma un diverso n° di massa (A) diversa massa

Frazionamento isotopico Effetto termodinamico La variazione naturale di abbondanza isotopica nelle molecole è conseguenza delle diverse proprietà chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento. Massa differente Effetto cinetico Effetto termodinamico (Differente energia libera) (Differente velocità di reazione)

Abbondanza naturale % media Standard di riferimento internazionale Rapporti isotopici normalmente indagati negli alimenti D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S Elemento Isotopo stabile Abbondanza naturale % media Standard di riferimento internazionale Idrogeno 1H 99.985 V-SMOW (Vienna –Standard Mean Ocean Water) 2H 0.015 Carbonio 12C 98.892 V-PDB (Vienna-Pee Dee Belemnite) Carbonato di calcio fossile 13C 1.108 Azoto 14N 99.6337 AIR (Azoto dell’aria) 15N 0.3663 Ossigeno 16O 99.7587 17O 0.0375 18O 0.2039

Lo spettrometro di massa isotopica (IRMS): misura di 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O Accoppiamento dell’IRMS con l’analizzatore elementare L’IRMS viene normalmente accoppiato con un analizzatore elementare in quanto misura solo molecole semplici (CO2,N2,CO) R è il rapporto tra l’isotopo meno abbondante rispetto a quello più abbondante

Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR) I = 1 => nucleo con distribuzione non simmetrica => breve T1 e T2 Bassa sensibilità (D poco abbondante e  <<) FT con impulso a 90° Solo molecole semplici (alcool, glicerina, acido acetico) Grandi quantità di campione (per alcool: 3 g) Sistema di lock, di solito alla frequenza del fluoro, per evitare drift del campo magnetico Disaccoppiamento del protone S/N > 150 (ca. 200 scansioni per spettro) 8 spettri per un tempo totale di ca. 4 ore Processore di dati spettrali dedicato

Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR) Spettrometro a 9.4T (400 MHz) (Bruker, Karlsruhe, Germania) dotato di campionatore automatico e corredato di sonda specifica per l'osservazione del "deuterio" (61.4 MHz per B0=9.4T), avente un canale di disaccoppiamento del protone e un canale di stabilizzazione del campo magnetico (lock) alla frequenza del fluoro. (D/H)I CH2DCH2OH (D/H)II CH3CHDOH R = 2 (D/H)II / (D/H)I

Scala che illustra qualitativamente la composizione isotopica del carbonio di alcune sostanze naturali CO2 in zone boschive d13C = - 11 ‰ atm CO2 CO2 Tecnogenico d13C= - 30 ‰ piante C3 (vite, alberi da frutta, erba, olivo) -22‰ -33‰ piante C4 (canna, mais) -10‰ -15‰ piante CAM (vaniglia) Petrolio Gas naturali Carbonati - 80 - 70 - 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 d13C (‰) d13C (PDB)

PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO 15N/14N NEI COMPOSTI VEGETALI Fissazione N2 atmosferico (0‰) -3/+1‰ (N2,NOx) Denitrificazione Residui organici (+10/+30 ‰) Precipitazioni Consumo da parte della pianta Materiale organico (R-NH2) -0,5‰ Ammonio (NH4+) Nitrati (NO3-) -12/-29‰ Minerali Nitrificazione ±1‰ Liscivamento

PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO D/H NEI COMPOSTI VEGETALI Composizione isotopica dell'acqua di falda effetto latitudine ciclo planetario dell'acqua effetto geografico - continentale effetto altitudine effetto climatico Evapotraspirazione fogliare (temperatura - umidità relativa) bietola, fragola ( 91 ÷ 93 ppm ) piante a ciclo C 3 mele, pere, ciliegie ecc ( 96 ÷ 108 ppm ) ( 95 ÷ 101 ppm ) Provenienza vegetale del l’alcool vite ( 98 ÷ 108 ppm ) piante a ciclo C (canna da zucchero, mais) 4 ( 110 ÷ 115 ppm )

FATTORI CHE INFLUENZANO I RAPPORTI ISOTOPICI DEI PRODOTTI ANIMALI I rapporti isotopici dei prodotti animali dipendono dal tipo di alimentazione e dall’origine dell’acqua L’ape assume gli zuccheri presenti nel nettare e li elabora senza alternarne i rapporti isotopici.

CHE INFORMAZIONI DANNO I RAPPORTI ISOTOPICI ? tipo di isotopo è influenzato da…. e può perciò determinare… Metabolismo (C3, C4, CAM) Aggiunta illecita di zucchero di canna e/o barbabietola (ad esempio a vino e succhi di frutta) Tenore di mais nella dieta animale 13C/12C, D/H 18O/16O, D/H Origine dell’acqua Annacquamento (ad es. nel vino) Aggiunta di sostanze di sintesi 13C/12C , D/H Sintesi chimica 18O/16O, D/H, 15N14N, 13C/12C Caratterizzazione di prodotti ad origine protetta e controllata Origine geografica

Analisi dei rapporti tra isotopi stabili di bioelementi (D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S)

Possibili applicazioni delle analisi isotopiche agli oli d’oliva Identificazioni di sofisticazioni con oli di altre specie vegetali o con oli di sintesi Identificazioni di sofisticazioni con oli di provenienza geografica diversa rispetto a quella dichiarata (oli DOP)

Stato applicativo delle analisi isotopiche nel settore degli oli Gaffney et al., 1979, Rossel, 1991 d13C di diversi tipi di oli: mais (ca. –12‰), girasole (ca. -27‰), soia (ca. – 28‰), palma (ca. – 27‰), cocco (ca. –25‰) ed arachidi (ca. –28‰) Bianchi et al., 1993 d13C di oli di diverse cultivar di olive d13C olio d’oliva: -27,18/-28,57‰ d 13C non dipende dalla varietà delle olive, né dal loro grado di maturazione Angerosa et al., 1999 d13C su olio, frazione sterolica e alcoli alifatici, d18O su olio Distinzione tra Stati Meditterranei (Spagna, Italia, Marocco, Tunisia) Accenni di discriminazione tra zone Italiane, areali marini e areali interni Zhang et al., 1998 D/H su glicerolo con SNIF-NMR

OLI D’OLIVA A DOP Normative di riferimento: - in ambito nazionale, la legge n. 169 del 05.02.1992 che ha sancito l'istituzione della DOC degli oli di tal tipo - in ambito comunitario, il Reg. CEE n. 2081/92 che offre la possibilità di estendere la tutela giuridica offerta dalla legge nazionale sulle DOC all'intero territorio della UE secondo le modalità della DOP e dell'indicazione geografica protetta (IGP). Requisiti minimi che deve possedere il disciplinare di produzione per una DOP la delimitazione della zona geografica; l’indicazione degli elementi comprovanti che la produzione, la trasformazione e l’elaborazione del prodotto hanno luogo nella zona delimitata; la descrizione del metodo di ottenimento del prodotto; d) gli elementi che comprovano il legame con l'ambiente geografico in particolare gli oliveti siti nelle zone di produzione di oli a denominazione di origine controllata, destinati alla produzione degli oli suddetti, devono essere iscritti in apposito albo pubblico degli oliveti, istituito presso ogni camera di commercio, industria, artigianato, agricoltura; e) i riferimenti relativi alle strutture di controllo: è stato infatti istituito il Comitato nazionale per la tutela della denominazione di origine controllata degli oli.

Metodi analitici di accertamento dell’origine geografica su oli d’oliva Panel Test, analisi di composti responsabili dell’aroma (Aparicio et al., 1996, J.Agric. Food Chem) Metodi chemiometrici applicati a diversi componenti dell’olio d’oliva (acidi grassi, steroli, alcoli alifatici e triterpenici, sostanza fenoliche, tocoferoli, trigliceridi e aromi). Forina e Tiscornia, 1982. Tsimidou et al., 1987. Alessandri et al., 1997. Webster et al., 2000 spettroscopia 13C-NMR e 1H-NMR ad alto campo (600 MHz) eseguita sull’olio tal quale (Sacchi et al., 1998; Mannina et al., 2000; Mannina et al., 2001) analisi dei rapporti tra isotopi stabili

Lavoro svolto da IASMA Nell’ambito della convenzione con il Ministero delle Politiche Agricole e Forestali: COSTITUZIONE DI BANCHE DATI ISOTOPICHE ANNUALI (dal 1998) 1998/1999: 80 campioni (Garda - Lombardia, Veneto, Trentino -, Liguria, Abruzzo, Toscana, Campania, Puglia, Sicilia, Sardegna) 2000/2001: 100 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia) 2001/2002: 84 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia): in via di completamento. 2002/2003: in via di raccolta campioni

Analisi effettuate

Valutazione statistica dei dati Analisi univariata: determinazione di media, dev. std., minimo massimo, analisi della distribuzione dei dati (rappresentazione in box-plot wishker) e ANOVA (Test di differenze significative tra medie come Test di Tukey) Analisi bivariata: correlazione tra variabili Analisi multivariata ‘descrittiva’: Principal Component Analysis Analisi multivariata discriminante: Stepwise Discriminant Analysis: selezione delle variabili più significative Analisi Discriminante Canonica con rappresentazione grafica bidimensionale dei risultati Analisi Discriminante di riclassificazione