OMEOSTASI IONICA E TOSSICITA’ CELLULARE Gli ioni regolano numerose funzioni cellulari (mantenimento del volume cellulare, controllo di attività cellulari in qualità di secondi messaggeri o cofattori enzimatici) => l’eccesso o la mancanza di uno specifico ione determina uno squilibrio e, in ultima analisi, tossicità cellulare. La differenza di concentrazione di alcuni ioni fra l’interno e l’esterno della cellula può essere notevole: Mantenendo una diversa distribuzione ionica attraverso le membrane, la cellula è in grado di immagazzinare energia, sottoforma di gradiente elettrochimico, che può essere utilizzata per: Guidare processi di trasporto Trasmettere segnali elettrici nelle cellule eccitabili e trasdurre messaggi intracellulari Produrre ATP nei mitocondri (cloroplasti e batteri) Pertanto i sistemi adibiti al controllo del gradiente ionico sono essenziali per la sopravvivenza della cellula.

PERTURBAZIONE DELL’OMEOSTASI IONICA E DANNO CELLULARE Gli effetti biologici degli ioni sono legati a meccanismi che ne controllano la concentrazione e la distribuzione subcellulare. Il controllo della distribuzione ionica avviene grazie alla presenza di: -POMPE che attraverso un cotrasporto (uniporto o simporto accoppiato) o un trasporto attivo accumulano ioni contro gradiente di concentrazione al di fuori della cellula (es. Na/K-ATPasi) o in compartimenti intracellulari (es. Ca-ATPasi) -CANALI che aprendosi favoriscono la penetrazione di ioni specifici all’interno della cellula Canali, ATPasi e sistemi di trasporto possono essere il bersaglio di sostanze tossiche di diversa natura (es. tossine animali, alcuni pesticidi, etc.) Trietilstagno: ionoforo

IL CALCIO COME MEDIATORE DI TOSSICITA’ Il calcio, in relazione alla sua funzione di secondo messaggero, può indurre meccanismi specifici di tossicità attivando proteasi, endonucleasi, fosfolipasi, disturbando la funzionalità mitocondriale ed inducendo attraverso queste vie apoptosi o necrosi. Le modificazioni transitorie del Ca2+ citoplasmatico regolano diverse funzioni cellulari: Secrezione Differenziamento e proliferazione Espressione genica Controllo di alcune reazioni metaboliche La [Ca2+]i è molto bassa (0,05-0,2 mM), per cui anche un minimo incremento dei livelli intracellulari dello ione può essere interpretato come segnale. La [Ca2+]i è controllata da diversi meccanismi: -pompe, canali e trasportatori di membrana -mitocondri (sono in grado di assorbire Ca2+ dal citoplasma quando raggiunge conc elevate) -proteine tampone (legano il Ca2+ citoplasmatico senza evocare una risposta cellulare) VOCC O ROC

Modificazioni transitorie della [Ca2+]i portano ad una serie di risposte fisiologiche legate all’attivazione di specifiche proteine calcio-dipendenti: Diversamente, l’evento tossico è spesso associato ad un aumento irreversibile e sostenuto della [Ca2+]i

Meccanismi attraverso cui un agente tossico può aumentare la [Ca2+]i: Aumento della penetrazione dall’ambiente extracellulare Aumento del rilascio dai depositi intracellulari Blocco dell’estrusione dalla cellula Inibizione dei meccanismi di compartimentalizzazione: Blocco dei sistemi di trasporto del RE (es. Ca2+-ATPasi) Blocco della capacità dei mitocondri di assorbire calcio Questi processi possono essere attivati indipendentemente o contemporaneamente => aumento irreversibile dei livelli di intracellulari di calcio => attivazione di processi citotossici => morte cellulare Esempi: Il mercurio attiva selettivamente i VOCCs, interagendo con i gruppi SH presenti all’interno del canale Il ter-butil-idroperossido ossida i gruppi SH della Ca2+-ATPasi localizzata sul RE, impedendone il funzionamento => blocco della compartimentalizzazione del calcio Alcuni agenti ossidanti (es p-benzochinone) aumentano il rilascio di Ca2+ attraverso tre possibili meccanismi: Rilascio aspecifico attraverso la membrana mitocondriale Reversione dell’uniporto di influsso dovuto alla perdita del potenziale transmembrana Attivazione dell’antiporto specifico Ca2+/H+.

ATTIVAZIONE DI PROTEASI: Le proteasi calcio-dipendenti appartengono al gruppo delle calpaine: - Enzimi ubiquitari - Funzionano a pH neutro - Generalmente associate alle membrane unitamente ad una proteina inibitoria (calpastatina) La localizzazione extra-lisosomiale permette a queste proteasi di partecipare a funzioni specializzate quali: - Rimodellamento del citoscheletro - Ricambio recettoriale - Modulazione della mitosi - Induzione dell’apoptosi (le proteasi/calpaine dell’involucro nucleare determinano compattazione cellulare e frammentazione del DNA) L’attivazione delle proteasi da parte del calcio non è basata su modificazioni allosteriche, ma su un’attivazione autocatalitica. ATTIVAZIONE DI ENDONUCLEASI: L’attivazione delle endonucleasi determina morte di numerosi tipi di cellule per attivazione del processo apoptotico. Esempio: Glucocorticoidi e TCDD attivano endonucleasi tramite l’aumento sostenuto di [Ca2+]i => frammentazione della cromatina in frammenti oligonucleosomici

ATTIVAZIONE DI FOSFOLIPASI: Le fosfolipasi: - Catalizzano l’idrolisi dei fosfolipidi di membrana - Sono distribuite nelle membrane biologiche Richiedono calcio per l’attivazione Per esempio, la PLA2 può generare lisofosfolipidi citotossici e metaboliti dell’acido arachidonico (mediatori di reazioni allergiche e infiammatorie). Inoltre, in presenza di un aumento sostenuto di calcio, la PLA2 può determinare un’eccessiva degradazione dei fosfolipidi di membrana => danno alle membrane cellulari. ALTERAZIONI DEL CITOSCHELETRO: La normale organizzazione del citoscheletro è essenziale per lo svolgimento di numerose attività cellulari quali: Trasporto intracellulare Secrezione Controllo del movimento e della forma Mitosi Il calcio può modulare l’interazione fra più componenti del citoscheletro, sia direttamente che attraverso enzimi Ca2+-dipendenti. Esempi: Un aumento dei livelli di [Ca2+]i provoca la dissociazione dell’a-actinina (una proteina che media l’interazione fra le proteine di membrana e i filamenti di actina) dai filamenti di actina, determinando un distacco di porzioni di membrana dal citoscheletro e la comparsa di estroflessioni sulla superficie cellulare (blebs). Questo stesso effetto può essere mediato anche da proteasi Ca-dipendenti che degradano selettivamente proteine in grado di legare l’actina o dall’attivazione dell’enzima trans-glutaminasi, come si osserva nell’apoptosi.

ALTERAZIONI DELL’ATTIVITA’ MITOCONDRIALE: Quando nella cellula si verifica un aumento di [Ca2+], questo viene riassorbito dai mitocondri attraverso un uniporto che utilizza energia. L’aumento di Ca2+ intramitocondriale riduce il potenziale di membrana mitocondriale per accumulo di cariche positive nella matrice => riduzione della forza motrice necessaria per far funzionare l’ATP-sintetasi => ↓ sintesi ATP Inoltre, il Ca2+ nel mitocondrio viene immagazzinato sottoforma di CaPO4 sottraendo un ulteriore intermedio per la sintesi di ATP. Il calcio può anche causare accelerazione della respirazione mitocondriale (attivando gli enzimi del ciclo degli acidi tricarbossilici, Ca2+-dipendenti), che generano substrati ed elettroni => mentre parte del sistema è attivato, l’enzima posto al termine (ATP-sintetasi) è bloccato => disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa => riduzione di ATP e formazione di specie radicaliche dell’ossigeno (ROS) => lipoperossidazione delle membrane e denaturazione di proteine. L’insieme di questi eventi determina blocco delle pompe di membrana per mancanza di ATP, degenerazione di proteine e strutture cellulari ad opera dello stress ossidativo e, infine, la morte. ATP-sintetasi: enzima posto al termine della catena di citocromi che catalizza il trasferimento di fosforo sull’ATP.

SODIO E POTASSIO [Na+]i = 20 mM [K+]i = 120 mM Gradiente fisiologico mantenuto da ATPasi di membrana SODIO: E’ il catione più importante a livello dei fluidi extracellulari. E’ coinvolto nella regolazione di: - Volume extracellulare - Osmolarità - Bilancio acido-base - Potenziale di membrana - Trasporto attivo attraverso la membrana Meccanismi di ingresso del Na+ nella cellula: ANTIPORTO Na+/H+: scambia Na+ extracellulare per H+ intracellulare ha affinità anche per Li+ e NH4+ inibito dall’amiloride e dai suoi analoghi stimolato dalla PKC E’ il maggiore regolatore del pH intracellulare e contribuisce al mantenimento del volume cellulare Sebbene l’idrolisi dell’ATP non sia richiesta per il trasporto degli ioni, il blocco metabolico (↓ ATP o ipossia) ha un effetto inibitorio sull’antiporto. L’ATP è infatti importante per la fosforilazione di alcuni siti presenti sul segmento citosolico C-terminale dell’antiporto => modulazione della velocità di trasporto degli ioni. 2) SCAMBIATORE Na+/Ca2+: regola le conc di [Ca2+]i (espellendo Ca2+ in cambio di Na+) Contribuisce all’aumento di Ca2+ nei miociti cardiaci durante ipossia, stress ossidativo o esposizione ad agenti tossici (inversione trasport.) Na+ H+ Na+ Ca2+

Sostanze che influenzano l’apertura del canale: 3) CANALI SPECIFICI (ROC o VOC): si aprono o si attivano in risposta all’interazione con uno specifico agonista o alla depolarizzazione della membrana e in pochi millisecondi si richiudono. L’organizzazione citoscheletrica è essenziale per la corretta regolazione di alcuni tipi di canale => condizioni che aumentano la frammentazione dei microfilamenti (citocalasina D, actina esogena+ATP, gelsolina) aumentano in alcune cellule la probabilità di apertura del canale al sodio. Sostanze che influenzano l’apertura del canale: Farmaci (anestetici locali, antiaritmici, anticonvulsivanti) Tossine animali (tetrodotossina, batracotossina, saxitossina) Contaminanti ambientali (piretroidi, DDT) Alterazioni nella neurotrasmissione e nella contrazione muscolare 4) COTRASPORTATORI: Na+/K+/Cl- regola l’influsso di elettroliti, mentre K+/Cl- ne controlla l’efflusso Meccanismi di efflusso di Na+ dalla cellula: POMPA SODIO-POTASSIO: scambia 3 Na+ per 2 K+ (antiporto) Circa 1/3 di tutto l’ATP prodotto dalla cellula è utilizzato per alimentare questa pompa E’ essenziale per il mantenimento della giusta [Na+]i La sua inibizione diretta (ouabaina, digitalici) o indiretta per carenza di ATP (cianuro, agenti disaccoppianti) comporta ↑[Na+]i => ↑ volume cellulare e perdita del gradiente di membrana 2) ANTIPORTO SODIO-CALCIO: scambia 3 Na+ per 1 Ca2+ Tetrodotossina: tossina del pesce palla (Tetraodontidae=pesci con 4 denti fusi in un becco) BATRACOTOSSINA: il più potente veleno animale conosciuto. Si trova nella pelle di alcuni anfibi (rane-freccia) SAXITOSSINA: spesso presente nei molluschi che si cibano di fitoplancton (mitili e vongole) PIRETROIDI: pesticidi, insetticidi

POTASSIO: E’ il catione principale all’interno della cellula, dove raggiunge conc anche 30 volte > di quelle plasmatiche Ruoli: Bilancia le cariche negative presenti su molecole organiche costitutive della cellula Contribuisce al mantenimento del potenziale di riposo Contribuisce a ripolarizzare la membrana cellulare al termine di uno stimolo depolarizzante Il potassio entra nelle cellula attraverso: - la pompa sodio-potassio canali specifici (i canali voltaggio-dipendenti svolgono importanti funzioni in molte vie di trasduzione del segnale nel SN, influenzando l’eccitabilità neuronale mediante modificazioni del potenziale di membrana a riposo, la forma e la frequenza dei potenziali d’azione e la soglia di eccitazione) Esempi: L’a-dendrotossina, un polipeptide presente nel veleno del serpente mamba, inibisce le correnti di potassio voltaggio-dipendenti (ad attivazione veloce e sensibili all’aminopiridina). Lo stress ossidativo a livello epatico indotto mediante t-butil-idroperossido induce restringimento cellulare a causa dell’apertura di canali del K+ sulla membrana plasmatica (x modificazione di gruppi SH delle proteine del canale ad opera di specie radicaliche dell’ossigeno?)