Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi Dipartimento di Scienze Biomediche

Il protocollo sperimentale

Informazioni sull’animale di laboratorio Specie utilizzata (ratto, topo, cavia, ecc.) Ceppo Ditta fornitrice Sesso Peso ----> età Digiuno (sì - no) Eventuali trattamenti (reserpinizzato, ecc.) Anestesia Metodica di sacrificio Note Sprague-Dawley outbred rats

Informazioni sulle soluzioni preparate Soluzioni fisiologiche di perfusione Soluzioni madri Pesata Diluizione Raccomandazioni per la conservazione della soluzione madre Note (preparare fresca ogni giorno, agitare prima dell’uso, ecc.)

Analisi dei risultati Raccolta dei tracciati, stampati, ecc. Immagazzinamento dei dati nel computer Catalogazione Elaborazione dei dati raccolti Produzione di un grafico

Annotazioni Le annotazioni/osservazioni spesso forniscono le informazioni più importanti per la comprensione dei risultati e quindi dell’intero esperimento!

Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (1) “Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose soluzioni saline. NaCl 0.9% = isotonica La soluzione fisiologica serve a mantenere un organo isolato in vita ed in condizioni stabili Manipolazione delle proprietà di una soluzione fisiologica

Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (2) La soluzione fisiologica deve: assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive O2 37°C corretta composizione ionica pH osmolarità

Uomo Ratto Porcellino d’India Na+ 150 151 145 K+ 3.6 5.9 7.4 Cl- 102 Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e delle proteine (g/100 ml) nel plasma di alcune specie Uomo Ratto Porcellino d’India Na+ 150 151 145 K+ 3.6 5.9 7.4 Cl- 102 110 105 Ca2+ 2.4 2.5 2.2 proteine 7.0 6.3 5.4

Na+ Ca2+ fenilefrina Ca2+ Na+ K+ IP3 Ca2+ Ca2+

Equazione di Nerst EK = ------- ln -------- nF [K+]i Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e potenziali di equilibrio nel muscolo scheletrico di mammifero Ione Concentrazione extracellulare Concentrazione intracellulare [Ione]o/[Ione]i Potenziale di equilibrio Na+ 145 12 +67 K+ 4 155 0.026 -98 Ca2+ 1.5 1x10-7 M 15000 +129 Cl- 123 4.2 29 -90 RT [K+]o Equazione di Nerst EK = ------- ln -------- nF [K+]i

Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati Ringer anfibi Krebs Tyrode Ringer Tyrode Locke De Jalon Reiter NaCl 111.0 118.0 137.0 154.0 115.0 KCl 1.87 4.69 2.68 5.63 4.7 MgSO4 --- 1.18 1.05 1.2 NaH2PO4 0.04 0.42 KH2PO4 Glucosio 11.0 5.6 2.8 10.0 NaHCO3 4.8 25.0 11.5 6.0 CaCl2 1.08 2.52 1.8 2.7 Gas aria 95% O2 5% CO2 O2 proteine

Le concentrazioni plasmatiche degli ioni presentano specie-specificità Concentrazioni (mM) di calcio “ionizzato” e totale nel plasma di alcune specie Specie “Ionizzato” Totale Cavia 1.7-1.8 2.0-2.3 Ratto 1.3-1.6 2.3-2.6 Uomo 1.1-1.2 2.2-2.9

Le soluzioni fisiologiche sono soluzioni tampone La soluzione tampone: miscela tra un acido debole e la sua base coniugata minimizza le variazioni di pH Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica:  pKa +1 pH fisiologico -1  Sufficiente capacità tampone

CO2(gas) CO2(acq.) H2CO3 + HCO3- pK’a = 3.8 H2PO4 + HPO4- pK’a = 7.2 Legge di Henry CO2(acq.) H2CO3 + HCO3- pK’a = 3.8 H2PO4 + HPO4- pK’a = 7.2 Ca2+

Il pH Importante per la vitalità e funzionalità del tessuto Determina il grado di ionizzazione delle molecole AH BOH A- H+ B+ OH- Attività <-----> Inattività Enzimi Livelli di [Ca2+]i Contrattilità muscolare Meccanismi osmotici Ecc.

L’osmolarità L’osmolarità di una soluzione deve essere vista come l’effettiva pressione osmotica che questa soluzione può sviluppare sui tessuti. Una osmole = 22.4 atm a 0°C (pressione osmotica di una soluzione 1 M di un non-elettrolita ideale). L’osmolarità di una soluzione reale può essere determinata direttamente dalla misura del punto di congelamento.

swelling Soluzione ipo-osmotica H2O

Soluzione iper-osmotica shrinking H2O

La temperatura Variabile fisiologica strettamente controllata nel vivente Influenza sia la risposta basale di un preparato che la responsività ai farmaci (utero di ratto) La riduzione della temperatura diminuisce il consumo di ossigeno ed il rischio di ipossia Influenza il pH delle soluzioni

L’ossigenazione Importante per la sopravvivenza di un tessuto Apparato sperimentale, spessore del tessuto, consumo di ossigeno tessutale (temperatura e attività) e pressione parziale di ossigeno nella soluzione fisiologica influenzano l’ossigenazione. La quantità di un gas disciolto in soluzione dipende da: solubilità del gas nell’acqua pressione del gas nella fase gassosa temperatura presenza di soluti nell’acqua

I calcoli in laboratorio

Dalla molarità ai grammi (1) Come si esprime la concentrazione di una soluzione M = n / V con V = litro

Dalla molarità ai grammi (2) Come si calcolano i grammi da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti M = n / V con n = g / PM ne consegue che M = g / PM x V ovvero g = M x PM x V

La pesata “approssimata” Come si calcolano i g da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti di una sostanza costosa g = M x PM x V Preparare 1 ml di una soluzione di quercetina (PM = 338) 10 mM g = 0.01 x 338 x 0.001 = 0.00338 pesata = 0.00221 g applico la proporzione 0.00338 g : 1 ml = 0.00221 g : X ml

La diluizione Come si prepara una soluzione a concentrazione e volume noti a partire da una soluzione più concentrata C1 x V1 = C2 x V2 1 indica la soluzione da preparare 2 indica la soluzione più concentrata C e V devono essere sempre espressi con la stessa unità di misura

Il problema solvente Molte sostanze impiegate nella ricerca di base e pre-clinica sono lipofile. dimetilsolfossido etanolo dimetilformammide metanolo