DAL DNA ALLE PROTEINE la trascrizione genica

Tratti della sequenza di DNA vengono trascritti in RNA

Ogni gene può essere trascritto e tradotto con diversi gradi di efficienza

Cosa è necessario per la trascrizione? DNA stampo RNA polimerasi Ribonucleosidi Trifosfati: ATP, GTP, CTP, UTP

I più comuni RNA: rRNA, mRNA e tRNA Regolata da segnali di inizio e termine Complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi

Modello a “chela di granchio” dell’RNA polimerasi Viene copiata in RNA una sola elica di DNA : elica di senso o filamento stampo

RNA complementare allo stampo è uguale al filamento codificante (al posto di T c’è U)

L’RNA pol batterica: 4 subunità a cui si associano: fattore :per riconoscere l’inizio fattore ρ che riconosce i segnali di terminazione

Promotori sequenza all’inizio del gene La subunità  associata a RNA pol riconosce il promotore, stabilisce la direzione della trascrizione RNA pol trascrive la catena di senso

L’ORIENTAMENTO del promotore determina quali tratti di DNA devono essere trascritti

La doppia elica si apre e inizia la sintesi di RNA dal nucleotide +1 rispetto al promotore

Ribonucleoside-PPP + RNAn= PP + RNAn+1 LEGAME FOSFODIESTRICO

RNA cresce in direzione 5’-3’ La trascrizione termina in sequenze del DNA ricche di CG Può intervenire il fattore ρ: si lega alla RNA pol e permette il suo distacco dal DNA

TERMINATORE RHO INDIPENDENTE

TERMINATORE ρ DIPENDENTE Attività ATPasica

mRNA batterici Pochi eventi di maturazione Appena trascritti vengono tradotti Alcune basi vengono metilate, piccola coda di rnt A

Procarioti: controllo espressione genica Batteri: regolazione della trascrizione nella fase iniziale Più geni sotto controllo di un solo promotore Operone: tratto di DNA che contiene promotore, operatore e geni strutturali

Operone lattosio Il lattosio viene scisso in galattosio e glucosio da 3 enzimi Gli enzimi vengono indotti solo in presenza di lattosio!!

La cellula usa preferibilmente glucosio: lac spento Quando non c’è glucosio si lega CAP Quando non c’è lattosio si lega il repressore Il lattosio agisce sul repressore e lo stacca

OPERONE DEL TRIPTOFANO (TRP) La presenza di Trp fa legare il repressore e la trascrizione si blocca; viene prodotto Trp solo in caso di necessità

NUMEROSE PROTEINE PARTECIPANO ALLO STADIO INIZIALE DELLA TRASCRIZIONE Eucarioti RNA pol I rRNA RNA pol II mRNA, piccoli RNA nucleari, microRNA RNA pol III tRNA, piccoli RNA citoplasmatici Queste RNA pol riconoscono promotori diversi Promotori eucariotici più complessi di quelli procariotici NUMEROSE PROTEINE PARTECIPANO ALLO STADIO INIZIALE DELLA TRASCRIZIONE

Eucarioti RNA pol hanno bisogno di FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE: legame al promotore TFIIA-B-D-E-F-H-J (per RNApol II)

Promotori eucariotici Es. RNA pol II: TATA box al -30/-25 e CAAT box al -80 TATA è riconosciuta da TBP, una proteina componente di TFIID

TBP riconosce TATA TBP+TAF= TFDII

Sequenze di DNA (-200) legano attivatori (recruitment) della RNA pol II

Gli attivatori legano il DNA e il complesso mediatore o direttamente il complesso di trascrizione

Maturazione dell’mRNA eucariotico

Procarioti: mRNA poligenico: presenza di più geni in una stessa unità trascrizionale Eucarioti: mRNA monogenico, cioè prodotto di trascrizione di un singolo gene

Maturazione mRNA eucariotico è complessa 1- aggiunta del CAP al 5’: GMP con gruppo metilico 2- taglio e coda di poli A (nucleotidi con adenina) al 3’ 3- splicing 4- editing

CAP: protegge 5’ e favorisce l’inizio della traduzione Taglio e poli A: regolazione traduzione e stabilità di mRNA

Il pre-mRNA è più lungo di mRNA maturo Lo SPLICING (taglia e cuci) permette di rimuovere gli introni

Riconoscimento preciso dei punti di taglio introne-esone e di giunzione esone-esone

Spliceosoma: snRNP, formate da piccoli RNA e proteine SnRNP U: U perché l’RNA è ricco di uridina

Stesso trascritto primario, prodotti proteici diversi SPLICING ALTERNATIVO Stesso trascritto primario, prodotti proteici diversi Combinazioni differenti di esoni Circa il 50% dei geni umani subisce splicing alternativo

Splicing alternativo della tropomiosina nel muscolo striato e liscio

Editing dell’RNA Cambiamento dopo la trascrizione dell’mRNA Addizione e/o delezione di residui di U in diversi siti della molecola, o cambiamento di molte U in C Modificazione di C e A

Gli mRNA vengono esportati nel citoplasma attraverso il complesso del poro nucleare Intervengono proteine per questo processo

Regolazione della trascrizione negli eucarioti L’espressione dei geni eucariotici è controllata essenzialmente all’inizio della trascrizione, anche se può essere regolata in altri momenti

Rapporto tra struttura della cromatina e trascrizione DNA + ISTONI= nucleosomi compattamento e de-compattamento della cromatina I geni trascritti si trovano in zone di cromatina decondensata

Modificazioni più comuni Acetilazione istoni Complessi rimodellatori della cromatina

FOSFORILAZIONE METILAZIONE ACETILAZIONE CODICE ISTONICO

Metilazione DNA La metilazione: C del 2-7% delle coppie CG Favorisce lo stato eterocromatico Metilazione e imprinting genomico: l’espressione di alcuni geni è determinata dall’origine parentale

Regolazione a livello post trascrizionale: i micro-RNA

microRNA inibiscono traduzione mRNA Molecole di RNA piccolissime: 18-25 nucleotidi miRNA: presenti in tutti gli eucarioti, trascritti da RNApol II

Meccanismo d’azione miRNA Complementarietà imperfetta: blocco traduzione mRNA Complementarietà perfetta: degradazione mRNA

Pri-miRNA è convertito in pre-miRNA da Drosha (RNAasi) Pre-miRNA è esportato nel citoplasma

DICER (endonucleasi) converte Pre-miRNA in RNA a doppio filamento Uno dei 2 filamenti è il mi-RNA e viene incorporato nel complesso RISC Il mi-RNA riconosce un mRNA bersaglio e blocca la traduzione

Il meccanismo dei miRNA è alla base dell’ interferenza da RNA indotta dai siRNA (Small interfering RNA) I siRNA hanno un ruolo importante in alcuni meccanismi antivirali o di modellamento della cromatina siRNA sintetici potrebbero avere applicazioni in ricerca e clinica

RNA INDUCED SILENCING COMPLEX: RISC

Molecole di siRNA derivano da lunghe molecole di RNA bicatenario prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula (virus) RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma

Degradazione RNA Gli introni sono degradati nel nucleo Controllo qualità: eliminazione di molecole difettose di RNA miRNA e siRNA mRNA eucarioti sono degradati a velocità diverse, ulteriore meccanismo di controllo dell’espressione genica

I fattori generici di trascrizione sono uguali per ogni polimerasi (es RNA pol II); le proteine che regolano i geni sono diverse per ciascun gene L’interazione tra molte proteine modula la trascrizione di ogni singolo gene