Fase di monitoraggio 24 maggio 2007- 7 Settembre 2008 Istituto di Genetica Vegetale, Perugia PROGETTO INTERREGIONALE OLVIVA: ANALISI DELLE ATTIVITA’ IN CORSO E RISULTATI RAGGIUNTI Fase di monitoraggio 24 maggio 2007- 7 Settembre 2008 AZIONE 1: 'Caratterizzazione molecolare e morfologica' Luciana BALDONI Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Obiettivi di OLVIVA Azione 1. Analisi morfologica e molecolare Analisi morfologica Discriminazione delle varietà attraverso l’uso di un set definito e comune di descrittori morfologici stabili per tutte le cultivar SCHEDA DI RILEVAZIONE DEI DATI MORFOLOGICI Definizione e applicazione di un metodo di fingerprinting applicabile a livello nazionale per la certificazione genetica del materiale di propagazione attraverso tecnologie biomolecolari Analisi molecolare Identificazione delle varietà Soluzione dei casi di sinonimia Discriminazione di cloni e varieta’-popolazioni Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Attività programmate Costituzione di una rete di laboratori Individuazione delle 200 varietà di interesse vivaistico per le regioni coinvolte nel Progetto Raccolta dei campioni da fonte qualificata (collezioni regionali e/o di istituzioni pubbliche di ricerca) Analisi molecolare e morfologica Validazione dei dati Sviluppo di una piattaforma diagnostica per il riconoscimento rapido dell’identità delle varietà di olivo più importanti Realizzazione e gestione di un data-base comune Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar da analizzare per ciascuna regione Regione Numero di varietà Liguria 8 Toscana 20 Umbria 10 Marche 8 Lazio 20 Campania 20 Molise 8 Basilicata 10 Puglia 40 Calabria 22 Sicilia 24 Sardegna 10 TOTALE 200 Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Varietà di ciascuna regione Laboratori di analisi morfologica Raccolta di campioni di foglie dagli stessi alberi Analisi dei parametri morfologici secondo la scheda di rilevazione Raccolta di immagini digitalizzate da campioni rappresentativi di frutti e foglie Laboratori di analisi molecolare Raccolta di campioni di foglie da 2 alberi/varietà Analisi con un set comune di 18 SSR Verifica della ripetibilità dei risultati tra laboratori mediante RING TEST Validazione dei dati complessivi SVILUPPO DEGLI STRUMENTI DI CERTIFICAZIONE GENETICA Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Set di marcatori SSR selezionati 1 DCA-18 2 UDO-43 3 DCA-16 4 DCA-09 5 GAPU-103 6 DCA-04 7 DCA-17 8 DCA-03 9 DCA-07 10 GAPU-101 11 DCA-14 12 EMO-90 13 DCA-15 14 DCA-05 15 DCA-13 16 GAPU-45 17 EMO-L 18 GAPU-71B I marcatori SSR sono stati sottoposti ad una selezione preliminare basata sui seguenti criteri: Potere di discriminazione (qualità dei segnali, assenza di bande multiple o alleli nulli, basso stuttering) Segregazione indipendente Informazioni di sequenza Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Liguria – P2 – SSSA-Pisa Campo collezione: Campo Catalogo Regione Liguria – La Spezia CASTELNOVINA LAVAGNINA LICCIONE MERLINA MORTINA PIGNOLA RAZZOLA TAGGIASCA 16 campioni (2 x 8 cv) analizzati con 18 loci SSR Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 8 cultivar liguri per la compilazione delle schede elaiografiche Forniti 5 campioni x Ring Test reciproco al CNR-IGV Perugia. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Toscana P6 – Università Siena Campo collezione ARSIA - Follonica AMERICANO COLOMBINO CORREGGIOLO CUORICINO GIOGOLINO GRAPPOLO GREMIGNOLO DI B. GROSSOLANA LECCIO DEL CORNO MADREMIGNOLA MIGNOLO OLIVASTRA ORNELLAIA PENDAGLIOLO PIANGENTE QUERCETANA ROSSELLINO SAN DONATO SAN FRANCESCO SCARLINESE 2 piante/cultivar (40 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Lazio – P10 – Università Tuscia, Viterbo Collezione Montopoli- ARSIAL BROCANICA CANINO CELLAVECCHIA CORVA CROGNOLO MARINA MAURINO MONTANESE OLIVAGO OLIVASTRA 11. OLIVASTRO 12. OLIVASTRONE 13. OLIVONE DI VITERBO 14. PENDOLINO 15. RAJA SABINA 16. REALE 17. ROSCIOLA 18. ROTONDA DI TIVOLI 19. SALVIANA 20. VALLANELLA 3 piante/cultivar (60 campioni + 5) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 10/18 loci SSR con 3 approcci: capillare, HRM e Beckman System. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Umbria – P3-CNR-IGV Perugia P4- Università Perugia MORAIOLO DOLCE AGOGIA FRANTOIO LECCINO RAIA RAIO BORGIONA SAN FELICE NEBBIA (o BIANCHELLA) NOSTRALE DI RIGALI ROSCIOLA DI PANICALE TENDELLONE PG01 ANT/15 PG02 BORGIONA clone 2 PG03 CMS/16A PG04 FRANTOIO 4 PG05 FRANTOIO 14 PG07 LECCINO 61 PG11 POCCIOLO clone 2 PG12 RAIA clone 1 PG14 TENDELLONE 1 2 piante/cultivar (24 + 9 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Collezione CRA-OLI Spoleto 2 piante/cultivar Collezione CRA-PAV , Roma 1 pianta/cultivar Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Marche – P3 - CNR-IGV Perugia P5 - Università Ancona Collezione ASSAM 1. RAGGIA 2. ASCOLANA TENERA 3. PIANTONE DI MOIANO 4. MIGNOLA 5. CARBO' 6. MIGNOLONE 7. SARGANELLA 8. CORONCINA 9. RAGGIOLA 10 PIANTONE DI FALERONE 2 piante/cultivar (20 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Puglia – P17 Università Bari P18 Università Bari ASCOLANA TENERA BELLA DI CERIGNOLA CAROLEA/OLIVONA CELLINA NARDÒ CERASELLA CIMA DI BITONTO CIMA DI MELFI CIMA DI MOLA CORATINA DOLCE DI CASSANO DONNA FRANCESCA DONNA GIULIETTA FRANGIVENTO FRANTOIANA FRANTOIO LECCINO MAIATICA MORAIOLO NOCELLARA NOCIARA NOLCA/NOCE 22. OGLIAROLA 23. OGLIAROLA BARESE 24. OGLIAROLA GARGANICA 25. OGLIAROLA LECCESE 26. OLIVA ROSSA 27. PASOLA 28. PASOLA DI ANDRIA 29. PENDOLINO 30. PICHOLINE 31. PROVENZALE 32. RACIOPPA 33. RACIOPPA LUCANA 34. ROTONDELLA 35. ROTONDELLA/CERASELLA 36. SANT’ AGOSTINO 37. SILLETTA 38. SIMONE O SIMONA 39. TERMITE DI BITETTO 40. TOSCANINA Campi collezione: Az. Didattico Sperimentale Valenzano – Università Bari Campo di Pre-Moltiplicazione – Palagiano Vivai Giannoccaro Campi privati 2 piante/cultivar 24/40 cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 13/18 loci SSR. Sulle stesse piante sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Calabria – P23 CRA-OLI Rende P22 Università di Reggio Calabria 26 varietà 2 piante/cultivar analizzate con i 18 loci SSR Campo collezione di Mirto-Crosia (CS) AGRISTIGNA BORGESE CAROLEA CASSANESE CICIARELLO CORNIOLA DOLCE DI CERCHIARA GERACESE IMPERIALE SANTOMAURO SINOPOLESE TOMBARELLO TONDA DI FILADELFIA TONDA DI FILOGASO TONDA DI STRONGOLI TONDA DOLCE TONDINA ZINZIFARICA MAFRA NERA DI CANTINELLE NOSTRANA OLIVELLA DI CERCHIARA OTTOBRATICA PENNULARA ROMANELLA ROSSANESE Non sono state riscontrate differenze tra le due piante analizzate per ogni varietà, eccetto che per Imperiale, Nera di Cantinella e Tonda di Filogaso, nelle quali le due piante si differenziano tra loro per uno o due alleli. La caratterizzazione morfologica è stata corredata da un’opportuna documentazione fotografica relativa ai principali caratteri morfologici di pianta, foglia, mignola, drupa ed endocarpo. Forniti 5 campioni x Ring Test reciproco al CNR-IGV Perugia. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Campania – P12 – Università Portici Campo collezione Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 20 cultivar campane di olivo per la compilazione delle schede elaiografiche 11. SALELLA 12. BIANCOLILLA 13. CORNIA 14. PAMPAGLIOSA 15. RITONNELLA 16. TENACELLA 17. RUVEIA 18. ASPRINIA 19. FEMMINELLA 20. OLIVA BIANCA ROTONDELLA PISCIOTTANA ORTICE RAVECE TONDA CARPELLESE OGLIAROLA CAMPANA ORTOLANA CAIAZZANA RACIOPPELLA 14/20 varietà sono state sottoposte all’analisi molecolare con 6/18 loci SSR Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Molise – P13 – Università degli Studi del Molise Campo collezione ARSIAM Per ciascuna cultivar sono state scelte e contrassegnate le piante apparentemente migliori e si è proceduto al prelievo del materiale vegetale da sottoporre a caratterizzazione molecolare con 18 loci SSR GENTILE DI LARINO OLIVA NERA DI COLLOTORTO AURINA ROSCIOLA DI ROTELLO CERASA DI MONTENERO SPERONE DI GALLO PAESANA BIANCA SALEGNA DI LARINO Dalle stesse piante madri delle principali cultivar di olivo molisane utilizzate per la caratterizzazione molecolare è stato prelevato materiale vegetale (foglie, frutti, fiori, ecc.) e sottoposto a caratterizzazione morfologica. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Basilicata – P14 Univerisità Basilicata P15 Univerisità Basilicata Campo collezione AUGELLINA CIMA DI MELFI CORNACCHIOLA FARESANA GHIANNARA MAIATICA OGLIAROLA DEL BRADANO OGLIAROLA DEL VULTURE SAMMARTINENGA SPINOSO 20 campioni (2 x 10 cv) analizzati con 18 loci SSR Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 10 cultivar lucane per la compilazione delle schede elaiografiche Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Sicilia – P24 – Università Palermo P25-CNR-IGV Palermo Campo collezione: ESA – Campo Carboi 24 cultivar analizzate con 15/18 loci SSR AITANA BIANCOLILLA BOTTONE DI GALLO BRANDOFINO CALATINA CAVALIERI CERASUOLA CRASTU ERBANO GIARRAFFA LUMIARO MINUTA 13. MORESCA 14. NASITANA 15. NERBA 16. NOCELLARA DEL BELICE 17. NOCELLARA ETNEA 18. NOCELLARA MESSINESE 19. OGLIAROLA MESINESE 20. OLIVO DI MANDANICI 21. PIRICUDDARA 22. SANTAGATESE 23. TONDA IBLEA 24. VERDELLO 2 piante adulte/cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Cultivar Sardegna – P3 CNR IGV Perugia P4 - Università Perugia Campo collezione: AGRIS 10 cultivar analizzate con 18 loci SSR 1. BOSANA 2. MANNA 3. NERA DI GONNOS 4. NERA DI VILLACIDRO 5. OGLIASTRINA 6. OLIEDDU 7. NERA DI OLIENA 8. PIBIREDDU 9. SEMIDANA 10. TONDA DI CAGLIARI 2 piante/cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare. Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Analisi molecolare Ciascun laboratorio ha analizzato i seguenti campioni: DNA delle varietà di ciascuna regione; DNA dei 5 campioni ‘anonimi’ previsti nel Ring Test e che il P3-CNR-IGV di Perugia ha inviato a tutti gli altri laboratori; DNA di 3 varietà (Frantoio, Leccino e Nociara) da utilizzare come riferimento comune. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Sono stati realizzati i seguenti esperimenti: Amplificazione PCR Separazione degli amplificati tramite elettroforesi su gel di agarosio o su capillare Trasformazione dei dati grezzi forniti dagli strumenti nelle lunghezze reali degli alleli microsatellitari (binning) Esperimenti di RING TEST Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Ring Test I dati ottenuti dai 9 laboratori sui 5 campioni ‘ignoti’ distribuiti dal P3-CNR-IGV Perugia sono confluiti presso lo stesso laboratorio, che sta provvedendo a: Verificare che i risultati ottenuti dai diversi laboratori sui campioni del Ring Test corrispondano tra loro e, in caso negativo, verificarne le ragioni e procedere alle azioni di correzione; Verificare che le lunghezze degli alleli ottenute dai diversi laboratori per le varietà di riferimento siano tutte identiche tra loro; Verificare che tutti i laboratori abbiano ottenuto il previsto range di alleli. Una volta svolto questo lavoro si potrà finalmente procedere ad elaborare congiuntamente i dati delle varietà di tutte le regioni coinvolte nel Progetto, per un’analisi complessiva dei casi di identità e di similarità. Queste attività sono in corso di realizzazione durante questa ultima fase del progetto e saranno oggetto del prossimo rendiconto. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Errori comuni nell’identificazione degli alleli Lab. 1 Lab. 2 Lab. 3 Lab. 4 Lab. 5 Lab. 6 244-254 243-253 243-243 242-252 Allele miscalling Lo stesso allele viene arrotondato a valori che differiscono tra loro di 1 o 2 basi Lab. 1 Lab. 2 Lab. 3 Lab. 4 Lab. 5 Lab. 6 160-204 185-204 Wrong allele Allele misinterpretation Lab. 1 Vede entrambi gli alleli Lab. 2 Vede solo allele corto Lab. 3 Vede solo allele lungo Allele drop out 198-200 198-198 200-200 Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Catalogo delle immagini Raccolta di campioni rappresentativi (almeno 50) di fiori, frutti e foglie Conferimento ad un unico laboratorio Acquisizione delle immagini digitalizzate in condizioni uniformi di luce, distanza focale, sfondo, ecc. Analisi computerizzata dei parametri morfometrici Pubblicazione cartacea e online delle immagini Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA P16 - Dipartimento di Biologia e Patologia Vegetale – Università Bari Aprile 2008 - Avvio in serra delle prove di valutazione della resistenza alla tracheoverticilliosi delle varietà di olivo fornite come talee autoradicate da alcune Regioni partecipanti al Progetto. Basilicata Augellina, Cima di Melfi, Faresana, Fasolina, Fasolona, Ghiannara, Maiatica di Ferrandina, Ogliarola del Bradano, Ogliarola del Vulture e Rotondella. Liguria Merlina e Razzola. Molise Aurina, Cerasa di Montrenero, Gentile di Larino, Oliva Nera di Colletorto, Paesana Bianca, Rosciola di Rotello e Sperone di Gallo. Sicilia Abunara, Biancolilla, Bottone di Gallo, Calatina, Cavalieri, Cerasuola, Erbano, Giarraffa, Minuta, Nasitana, Nerba, Nocellara del Belice, Olivo di Mandanici, Piricuddara e Vaddarica. Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008

Progetto Interregionale OLVIVA Gravità dei sintomi interni (Curva di progressione della malattia nel tempo e Imbrunimento vascolare) della verticilliosi su piante di olivo di due anni di età provenienti dalla Basilicata, Liguria, Molise e Sicilia Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008