Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa …….

Trasformazione batterica Uptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare Cell wall GFP Bacterial chromosomal DNA Beta lactamase (ampicillin resistance) pGLO plasmids

Metodi di trasformazione Elettroporazione shock elettrico che rende le membrane cellulari permeabili al DNA(si usa anche per le lellule eucariotiche) Calcio cloruro/Heat Shock Cellule, rese competenti chimicamente, incorporano DNA nudo dopo heat shock

Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule competenti CaCl2 genera buchi nella membrana dei batteri rendendoli capaci di incorporare DNA

Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule competenti- cont CH2 P Base OH Sugar Gli ioni of Ca+2 carichi positivamente mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA

Attenzione!!!! CaCl2 rende le cellule più fragili Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)

Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme 45 minuti in ghiaccio Il DNA aderisce ai batteri Shock termico 42 °C per 2 min Il DNA entra nei batteri

Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - cont Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che permette la replicazione del DNA plasmidico nelle cellule in cui è entrato 1 ora a 37 °C Questo periodo permette alle cellule di esprimere il gene di resistenza all’ antibiotico (ampicillina) e di potere replicare successivamente sulle piastre

Controlli della Trasformazione

Spread plate

Spread plate

Spread plate Piastre rigorosamente asciutte MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl Raffreddare bene la bacchetta di vetro Lasciare asciugare prima di spostare le piastre Le piastre danno conteggi affidabili solo se il numero di colonie é tra 30 e 500

Finalmente…. Se non avete la disponibilità di un incubatore a 37 °C potete lasciare le piastre sul banco. Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONE Colony Forming Unit (CFU)/µg DNA Calcolre i µg totali di DNA usati Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se é stata fatta) Contare le colonie Moltiplicare il numero di colonie per la diluizione di piastratura Dividere per i ng di DNA utilizzato Efficienza di trasformazione (CFU/g)= n°colonie  g DNA